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本研究通过观察曲马多中毒死亡案例、曲马多中毒小鼠延脑和海马的GABAA受体α1亚单位(GABAAα1)和B受体1亚单位(GB1)的表达,探讨曲马多中毒时延脑呼吸中枢和海马的GABAAα1和GB1的变化,为解释曲马多中毒死亡机制提供了新的思路。
实验材料与方法：
收集中国医科大学法医学院法医病理科室2005年～2009年间检见的曲马多中毒死亡案件5例作为实验组,另选取其他非中毒原因死亡的5例作为对照组。分别取延脑固定备用。
8周龄健康清洁级昆明系小鼠90只,体重30～38g,常温饲养,光暗周期为12小时,实验前在上述条件下适应性喂养3天。实验过程中遵循实验动物使用伦理原则相关规定执行。其中40只随机分为4组,每组10只,分别为急性中毒组、亚急性中毒组、慢性中毒组及对照组。急性中毒组每日以曲马多200mg/kg腹腔注射一次,对照组以等体积生理盐水代替曲马多,共一天;亚急性中毒组每日以曲马多100mg/kg腹腔注射一次,对照组以等体积生理盐水代替曲马多,共30天;慢性中毒组每日以曲马多50mg/kg腹腔注射一次,对照组以等体积生理盐水代替曲马多,共90天。其余50只随机分为10组,每组5只,由1d组、2d组、3d组、4d组、5d组、6d组、7d组、8d组、9d组及对照组组成。1d组～9d组每日以曲马多100mg/kg腹腔注射一次,按组别分别注射1～9日;对照组以生理盐水代替曲马多腹腔注射。最后一次给药后24h麻醉处死,取延脑及单侧大脑,4％多聚甲醛溶液/0.1mol/LPBS(pH7.4)固定48h,经水洗、脱水、透明、石蜡包埋,制作5μm连续切片。剥离另一侧海马组织用冷生理盐水清洗后加蛋白裂解液匀浆,用于Western blot检测。应用免疫组织化学染色和Western blot检测GABAAα1和GB1表达。以标准分子量Maker作指示,在PVDF膜上阳性表达显黑色谱带,黑色谱带的浓度和大小表示蛋白表达的强弱。
应用Image-pro Plus6.0软件测各切片和各谱带的积分光密度值,测得数据用均数士标准差(x±s)表示。用SPSS13.0 forWindows进行独立样本t检验或单因素方差分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果：
与对照组小鼠相比较,曲马多中毒各组和曲马多致惊厥组小鼠于给药后均不同程度出现对声音及触摸刺激反应性增高,竖尾、跳跃、尖叫、共济失调等现象,严重者呈癫痫样发作表现。上述反应于给药后即出现,多持续1至2小时后逐渐消失。
免疫组织化学染色显示,其他非中毒原因死亡组延脑孤束核和疑核神经元GABAAα1和GB1均呈阳性着色,但着色较浅,曲马多中毒死亡组延脑孤束核和疑核神经元GABAAα1和GB1免疫组织化学染色阳性着色强度均明显高于对照组,两组间阳性着色积分光密度见明显差异(P＜0.05);免疫组织化学染色和Western blot检测显示,正常小鼠脑组织神经细胞可见GABAAα1和GB1阳性表达,曲马多急性中毒组GABAAα1表达减少,GB1未见明显变化,亚急性和慢性中毒组GABAAα1和GB1均较对照组表达增强,除GB1急性组与对照组间,其余各组与相邻上组的阳性表达积分光密度均有统计学意义(P＜0.05)。Western blot检测显示,1d组GABAAα1阳性表达骤降,1d～7d阳性表达逐渐增强,7d重新达到正常值,各组间阳性表达积分光密度值均具有统计学意义(P＜0.05);GB1在1d～9d阳性表达未见明显变化,各组间积分光密度值无统计学意义(P＞0.05)。
结论：
1、短时间段曲马多中毒后海马中GABAAα1表达降低,GB1表达未见明显变化,提示GABAAα1减少导致海马区的兴奋性增强是短时间段内曲马多用药过量时发生癫痫发作的原因,GB1与短时间段内曲马多用药过量时发生的癫痫发作无关。
2、曲马多中毒者延脑孤束核和疑核,亚急性、慢性曲马多中毒小鼠延脑GABAAα1和GB1表达升高,提示长时间服用曲马多导致中枢性呼吸抑制,GABAAα1和GB1高表达可能是长时间服用曲马多导致中毒死亡的原因。