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目的胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)成为当今生命科学和生物技术研究的热点,这是因为它具有自我更新和多能分化的能力。多年来,“成体组织中是否存在胚胎干细胞”一直是一个很有争议的问题,很多实验室已报道可以从骨髓中分离出来ESCs样的多能干细胞,这些细胞都表达ESCs特异性标志Oct4基因,能像ESCs一样无限分裂繁殖,而且可以分化成几乎所有类型的细胞。但是对于这些原始细胞的来源和存在机制,人们并不清楚。因此,骨髓中是否存在ESCs就变成了一个很有争议的问题。之前的研究都是通过不同的方法从骨髓中分离、提取并培养这些ESCs样的干细胞,而我们首次通过相反的方式直接将小鼠ESCs注入到小鼠的骨髓腔里,通过观察ESCs在体内的分布生长情况,从而思考体内是否有这样一个适宜ESCs生存的环境。方法为了更好地追踪ESCs在体内的生长情况,我们新建两株带绿色荧光标记(green fluorescent protein, GFP)的ESCs——oGFP+ESCs(C57BL／6xOct4／EGFP转基因OG2小鼠)；和aGFP+ESCs(129／SvxCAG／EGFP转基因C57BL／6-Tg小鼠)。oGFP+ESCs中GFP的表达受Oct4启动子调控,Oct4表达时GFP才表达；aGFP+ESCs中GFP的表达受chicken-beta-actin启动子调控,无论细胞分化与否,GFP均表达。为了避免了ESCs在体内其它器官的阻滞和损失,我们直接将ESCs通过胫骨注射植入到同源的C57BL／6小鼠(分照射组和非照射组)骨链腔内。移植后,通过双光子荧光显微镜来观察GFP+细胞在小鼠骨髓腔里存活的时间和状态。另在不同的时间点,我们从移植小鼠的骨髓腔里再次分离出这些GFP+的细胞,采用建立ES细胞系的方法使这些Oct4+-GFP+细胞建成稳定细胞系,并检测这些新建细胞系的功能。通过基因芯片检测来比较这些细胞系和母代ESCs在基因表达水平上的差异。另一方面,我们通过流式细胞学检测和体外培养的方式,分析移植的ESCs在骨髓这种造血微环境下的分化特征。结果通过双光子荧光显微镜观察发现100天后,骨髓中仍然存在Oct4-GFP表达的类似ESCs的细胞。大多数GFP+细胞位于移植侧胫骨的注射部位,也有少部分GFP+细胞位于注射骨对侧的骨髓腔内。在不同的时间点,我们从移植小鼠的骨髓腔里分离出这些Oct4+-GFP+的细胞,建成稳定细胞系。到目前为止,我们成功建立了8株细胞系,形态同ESCs。通过对这些Oct4+细胞系的功能性检测发现它们具有与ESCs相似的特性,但这种细胞系生成嵌合鼠的嵌合率很低,且不能生殖系传递。芯片结果显示这些细胞与母代ESCs比较,部分基因表达水平发生了改变,表观遗传学也发生了逐渐的变化。另外,移植的ESCs在骨髓腔内大多数分化成了非造血的细胞,形态多样,与骨质连接紧密,而仅有少部分分化成了造血细胞,并可进入血循环。结论1)我们的研究首次通过直接将ESCs移植入小鼠骨髓腔来证实了成体环境中长期存在ESCs的可能性,对以后干细胞的应用,在成体内的发育和分化研究具有一定的提示作用；2)由于原始的胚胎干细胞在体内可以长期存在,因此在使用ESCs或ESCs衍生物做细胞治疗或移植过程中,安全性一定要长期关注；3)胚胎干细胞在成体骨髓中存活一段时间后,逐渐发生了表观遗传学方面的变化,这种变化影响了ESCs的多能性改变,因此在以后细胞移植过程中,我们需要关注这些细胞表观遗传学方面的影响；4)ESCs在骨髓腔内存活一段时间后,大多数分化成了非造血细胞。我们的研究首次说明了ESCs在骨髓微环境的分化趋势,对ESCs的分化潜能和周围环境的关系以及ESCs的应用具有一定的提示作用。