拟南芥衔接蛋白类似物突变体defective pollen tube growth1的研究

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被子植物花粉(管)与柱头的相互作用是授粉识别的关键步骤,决定花粉是否能够在柱头上萌发以及产生的花粉管是否能够穿过柱头在雌蕊组织中生长。对花粉(管)与柱头相互作用机制的研究是理解被子植物有性生殖和授粉识别的基础。  我们鉴定到了一个拟南芥T-DNA插入突变体,它的杂合突变体自交后代的野生型和杂合体比例接近于1∶1,没有鉴定到纯合突变体。同时,杂合突变体的角果种子数与野生型无明显差异。将杂合突变体与野生型植株互交,鉴定后代的基因型。发现只有当杂合突变体作为父本的时候,突变的基因不能向后代传递。推测该基因突变导致雄配子体功能异常,我们将该突变体命名为defective pollen tube growth1(dg1)。为了进一步验证该突变体的表型是由于dg1突变导致的,我们构建了Lat52∷amiDG1载体,并转化拟南芥。我们发现Lat52∷amiDG1转基因植株的表型与T-DNA插入突变体的表型相似,突变的花粉管与RNAi植株的花粉管在离体和活体状态下不能正常的萌发和生长。  蛋白的序列分析表明,DG1是一个衔接蛋白(Adaptor protein,AP)蛋白类似物。DG1在植物中是一类十分保守的蛋白,但是在动物中并没有找到它的同源蛋白。细胞内吞过程中,AP蛋白起到连接网格蛋白和货物分子的作用。植物AP蛋白参与了包括花粉管生长在内的多个发育及生理活动过程。  qRT-PCR、GUS染色分析表明,DG1在拟南芥的幼苗的根尖和茎端,以及根和叶片的输导组织有表达。在花粉发育过程中只能检测到DG1微弱地表达,但是在成熟的花粉粒中没有检测到DG1的表达。在水合花粉和花粉萌发过程中,DG1的表达明显上升,并在花粉管顶端一直保持较高水平。  通过检测pDG1∷DG1-GFP稳定表达植株中的GFP信号,我们发现DG1主要定位在花粉管亚顶端的质膜上,并在细胞质中呈现弥散状分布。  利用囊泡运输抑制剂处理pDG1∷DG1-GFP植株的花粉管,发现用Tyrphostin A23(Tyr A23)处理花粉管时,DG1-GFP在花粉管亚顶端质膜上的定位消失,但是Wortmannin和brefeldinA(BFA)处理不影响DG1-GFP的定位。TyrA23能够特异性抑制货物蛋白的胞吞基序YxxΦ与衔接蛋白复合物μ亚基的相互作用,从而抑制货物蛋白通过网格蛋白介导的方式内吞。我们的结果表明,DG1的定位依赖于网格蛋白介导的内吞过程。
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