基于RNA-seq的花生盐胁迫差异表达基因及LEA蛋白家族成员分子进化分析

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前期研究中,我们通过平阳霉素离体诱变结合羟脯氨酸定向筛选获得几个花生耐盐突变体,经过对后代种子的盐胁迫发芽试验,获得在0.7% NaCl胁迫条件下发芽率达到50%的稳定遗传的耐盐材料S2。对生长6周龄耐盐突变体(S2)与对照组(S4)进行盐胁迫处理,取处理0,6,12,24和48h的叶片进行转录组测序,并对各样品分别进行表达谱分析。  通过多重比对共发现了189条DEGs,其中有166条DEGs是与盐胁迫响应相关的,有21条是未知功能的新基因。通过聚类分析与KEGG富集通路分析对DEGs进行基因功能和通路分析发现这些差异表达的基因主要与转录翻译、信号转导以及合成代谢相关。同时详细研究并发现了在盐胁迫处理相同的时间,耐盐突变体(S2)与对照组(S4)相比发生差异表达的基因:在花生受到盐胁迫时一些人们已知的主要的转录因子家族的基因在叶片中是差异表达的,另外通过分析还确定了与细胞壁松弛和加固相关的,与胚胎发育晚期丰富蛋白家族相关的,与脂肪酸生物合成与代谢相关的和其它的例如防御素、普遍的应激蛋白、金属硫蛋白、过氧化物酶等前人已经报道的编码胁迫响应蛋白的差异表达基因。此外还发现了其它未知功能的与胁迫响应相关的差异表达基因。  通过搜索在转录本中共找到注释为LEA家族基因的unigene80条,通过在花生野生种基因组数据库中进行比对共得到77条相关基因,然后通过分析相关基因注释以及进行蛋白质保守结构域分析,最终在花生中共获得34个LEA家族基因,并依据其所具有的保守结构域把花生中的34个LEA基因分为Dehydrin、LEA_1、LEA_2、LEA_3、LEA_4、LEA_5、LEA_6、SMP和Em组。除Em组外其它的亚家族在其他模式植物中都能发现。然后在模式植物拟南芥、水稻、江南卷柏、小立碗藓和莱茵衣藻中进行Blastp和tBlastn比对,发现花生中的很多亚家族LEA蛋白与低等模式物种中LEA蛋白不具备同源性。对花生各亚家族与模式植物中同源性高的LEA蛋白进行motif分析并构建系统发育进化树,综合其结果发现花生中只有SMP和LEA_5亚家族在进化过程中比较保守,其它亚家族在进化过程中保守性不高。同时还进行了各个LEA蛋白的理化性质和在细胞和染色体上的定位研究。另外还对LEA基因A组中的启动子进行分析。  选择6个差异表达的LEA基因中的4个进行基因和启动子序列的测序,结果发现了c35561_g1中启动子序列在耐盐突变体与对照组相比多了一个ABRE顺式作用元件,拥有对照组不具有的MBS,而其它的启动子序列顺势作用元件相同。
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