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白梭吻鲈(Sander lucioperca),属于鲈形目(Perciformes)、鲈科(Percidae)、梭吻鲈属(Sander),又称为梭鲈。白梭吻鲈是一种极具养殖潜力的亚冷水性鱼类,然而,近年夏季高温已经严重威胁到白梭吻鲈的养殖。课题组前期研究了不同温度下热胁迫对白梭吻鲈肝脏的影响,但是对其在不同热刺激时间下的转录表达谱及其生理生化响应仍然未知。本研究对白梭吻鲈进行了持续的热胁迫(29℃,0–48 h),对热胁迫组(29℃,0 h)白梭吻鲈肝脏进行了转录组分析,筛选了与白梭吻鲈热胁迫响应有关的候选基因和通路,检测了不同热胁迫时间下白梭吻鲈肝脏的氧化应激状态,观察了肝脏组织损伤程度,探究了肝脏细胞凋亡情况,测定了热胁迫下白梭吻鲈肝脏抗氧化酶基因及热休克蛋白(HSPs)家族基因的表达水平。本研究结果将为进一步解析白梭吻鲈热胁迫响应分子机制提供基础数据,具体研究如下:1热胁迫下白梭吻鲈肝脏转录组分析以23℃为对照组,热胁迫(29℃,0 h)为实验组,对白梭吻鲈6个肝脏组织样品进行转录组测序,共获得46.57 Gb clean reads,Q30碱基百分比均大于93.59%,组装后共获得100,871个Unigene,Nr功能注释显示共有23,648个Unigene被成功注释,分别有5474个、12286个、13036个unigene注释到COG、GO和KEGG数据库。Unigene比对上大黄鱼(Larimichthys crocea)功能基因序列最多,共3613个(16.54%),表明白梭吻鲈与大黄鱼的亲缘关系较近。与对照组相比,热应激下共发现403个差异表达基因,其中表达上调的基因278个,下调的基因125个。从转录组差异表达基因中选出8个应激相关基因进行荧光定量PCR验证,结果显示:STAT1、LDH-A、RHEB和HES-1B基因表达显著升高,LFNG、PIK3R1、GDF2和HMGB2基因表达显著下降,这些基因的表达模式与RNA-Seq结果一致,表明本研究中的高通量测序结果较为可靠。通过分析差异表达基因的GO和KEGG注释结果,发现热胁迫下白梭吻鲈差异表达基因多富集到内质网中的蛋白质加工、胰岛素信号通路和免疫相关通路中,表明白梭吻鲈主要通过激活内质网中的蛋白质加工、胰岛素信号通路和免疫相关通路来抵抗高温胁迫引起的氧化应激,降低损伤程度。2热胁迫对白梭吻鲈肝脏氧化应激及组织损伤的影响以23℃为对照组,以1℃/h的升温速度从23℃升高到29℃,最终在29℃下保持48 h,分别在胁迫0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h时进行采样,检测了在不同热胁迫时间下肝脏氧化应激相关参数和肝损伤参数,进行了肝脏组织学观察。结果显示:与对照组相比,29℃(0 h)实验组并没有明显的病理学变化。热胁迫3 h、6 h、12 h和24 h实验组与对照组相比,白梭吻鲈肝脏出现了细胞核溶解和空泡变性等病理学现象,热胁迫48 h时白梭吻鲈肝脏细胞核溶解和空泡变性现象加剧,肝细胞边界模糊,病理学变化最为严重。当水温从23℃(对照)升至29℃(0 h)时,白梭吻鲈肝中谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性和还原性谷胱甘肽(GSH)含量降低,总抗氧化能力(T-AOC)活性显著增加,而总超氧化物歧化酶(T-SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性与丙二醛(MDA)含量没有明显变化。在29℃(3 h)时,T-AOC活性下降。在热胁迫3 h时,T-SOD和CAT的活性以及GSH含量显著增加(P<0.05),此后均降低。在热胁迫6 h时,GPx和T-AOC的活性增加,然后降低。在热胁迫0-3 h内,MDA含量均无显著差异,但6 h组的MDA含量显著增加,然后随着热胁迫时间的持续而降低(P<0.05)。此外,与对照组相比,高温处理组的ALT和AST活性分别在0 h和3 h时均显著升高(P<0.05),但随着热胁迫时间的持续而下降。3热胁迫下白梭吻鲈肝脏细胞凋亡的分析实验方法同实验2。利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测白梭吻鲈肝脏细胞凋亡情况,并测定了细胞凋亡相关基因的表达水平。结果显示:对照组肝脏细胞核大多是蓝色,棕色细胞核数目较少。热胁迫后,白梭吻鲈肝脏细胞凋亡现象明显加重,热胁迫组各时间点的肝脏细胞凋亡指数显著升高(P?<0.05)。q RT-PCR结果显示与对照组(23℃)相比,热胁迫(29℃,0 h)时白梭吻鲈肝脏中p53、Bax、Apaf-1、Caspase9和Caspase3的m RNA表达水平显著增加,但随着热胁迫时间的持续,其表达水平呈下降趋势。4热胁迫对白梭吻鲈肝脏HSPs及抗氧化酶基因表达的影响实验方法同实验2。通过荧光定量PCR测定了白梭吻鲈肝脏HSPs及抗氧化酶基因在不同热胁迫时间下的表达情况。结果显示:与对照组相比,热胁迫0 h时白梭吻鲈肝脏中HSP70和HSP90α的m RNA表达水平显著增加,但随着热胁迫时间的持续其表达水平显著下降(P?<0.05)。在热胁迫早期HSC70、GRP78和GRP94的m RNA表达水平显著增加(P?<0.05),并都在热胁迫3 h时达到峰值,随后他们的总体表达水平下降。热胁迫(29℃,0 h)时白梭吻鲈肝脏中Mn-SOD和GPx7的m RNA表达水平显著增加,但总体表达水平随着热胁迫时间的持续而下降(P?<0.05)。在热胁迫早期阶段CAT和GPx1的m RNA表达显著增加,分别在热胁迫3 h和6 h达到峰值。GPx3 m RNA表达水平在热胁迫3 h显著增加并达到峰值。Cu/Zn-SOD m RNA的表达水平在热胁迫0 h有所下降,然后增加并在6 h达到峰值。综上,短期热胁迫能激活白梭吻鲈抗氧化系统和热休克蛋白家族基因表达来保护细胞免受氧化损伤。持续热胁迫会引起白梭吻鲈肝脏氧化应激,从而导致肝脏组织损伤和细胞凋亡。