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目的:本次研究的主要目的是提取、分离、纯化东北鹤虱的多糖成分,进而研究其部分性质、多糖含量及单糖组成,并对其免疫活性进行初步研究。
方法:1.采用水提醇沉法提取东北鹤虱粗多糖,醇沉物经过无水乙醇、丙酮反复洗涤,室温减压干燥,得疏松的东北鹤虱粗多糖(LEGCPS)粉末。2.LEGCPS的分离纯化LEGCPS经过5%三氯乙酸结合Sevag法去除游离蛋白后得东北鹤虱多糖(LEGPS),在此基础上,选取DEAE-SepharoseFastFlow凝胶为介质,利用离子交换法对LEGPS进行分离纯化,依次用Tris-HCl溶液、0.2MNaCI溶液、0.5MNaCl溶液、1MNaCl溶液进行洗脱。采用硫酸-蒽酮法检测洗脱液的A625,绘制洗脱曲线,合并主峰,冻干。采用SephacrylS-200凝胶作为介质,利用凝胶层析法,进一步分离DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换层析柱中洗脱组份,以双蒸水洗脱,采用硫酸-蒽酮法检测洗脱液的A625,绘制洗脱曲线,合并主峰,冻干,即得。3.利用斐林试剂反应、淀粉实验、双缩脲实验、茚三酮实验化学方法、紫外光谱分析及薄层色谱等方法对产物进行定性分析,采用蒽酮硫酸比色法对产物进行多糖定量分析,采用考马斯亮蓝染色法对中间产物进行蛋白质定量跟踪。4.通过噻唑蓝比色法(MTT)观察东北鹤虱多糖在体外对小鼠脾淋巴细胞增殖的直接促进作用,及对有丝分裂原刀豆蛋白ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的协同作用,以初步证明其免疫活性。
结果:1.LEGCPS为棕黄色粉末,收率为4.68%。2.LEGCPS经脱蛋白、透析后所得LEGPS,为浅棕色粉末,收率为21%,经DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换层析柱后,依据出峰顺序将其分别定义为LEGPS-I、LEGPS-II、L,EGPS-III、LEGPS-IV,LEGPS-II为主要洗脱峰,浅黄色粉末,收率为32.63%,说明LEGPS主要集中在0.2MNaCl洗脱组份上。LEGPS-II经SephacrylS-200凝胶柱层析后,依据出峰顺序将其分别定义为LEGPS-II-A、LEGPS-II-B,均为白色粉末。LEGPS-II-A为主要洗脱峰,收率为32.63%,故仅对LEGPS-II-A进行了相关的定性、定量及免疫活性探索。3.LEGPS-II-A经多种方法定性分析,确定其不是多肽和蛋白质,不含或含极低量氨基酸、蛋白质的非淀粉类多糖,LEGPS-II-A经蒽酮硫酸比色法测定,多糖含量达57%,该多糖为杂多糖,由葡萄糖,木糖,阿拉伯糖三种单糖组成。4.LEG-CPS在0.04~5mg/ml浓度范围内,LEGPS在0.1~5mg/ml浓度范围内,均对ConA诱导的淋巴细胞增殖反应有显著协同作用,并且作用随剂量增大而增强。LEGPS-II-A在0.01~0.2mg/ml浓度范围内均具有明显的直接促进小鼠淋巴细胞增殖的作用,并且作用随剂量增大而增强,但未见对ConA诱导的淋巴细胞增殖有明显作用。
结论:本次研究确定了东北鹤虱多糖的提取、分离路线和纯化方法,得到PEGPS-II-A,为不含或含极低量氨基酸、蛋白质的非淀粉类多糖,多糖含量达57%,并且在体外具有明显的免疫增强作用,由此提示,PEGPS-II-A是一种免疫活性多糖,通过对机体免疫系统的调节作用,增强机体的免疫功能,其进一步的免疫调节作用及其机制还有待继续深入研究。