甜瓜CmHBⅡ-1及CmFER10基因的克隆及其在果实发育中功能的初步分析

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甜瓜(Cucumis melo L.)是一年生匍匐或攀岩生长的双子叶草本植物,也是一种重要的经济瓜果作物,在全世界被广泛栽培。本研究以甜瓜品种河套蜜瓜(Cucumis melo L.cv Hetao)为研究材料,通过对本实验室前期获得的河套蜜瓜的果实转录组数据进行了初步分析,选择了在果实发育过程中差异表达的两个基因CmHD-ZipⅡ(HomeodomainLeucineZipper)家族转录因子和CmFER10(FERONIA receptor-like kinase)作为候选基因,对其进行克隆及果实发育中的功能分析,主要结果如下:(1)采用生物信息学的方法,在甜瓜基因组中鉴定了9个HD-ZipⅡ家族成员和15个FER家族成员。染色体定位分析发现CmHBⅡ-1和CmFER10基因分别位于甜瓜1号染色体和10号染色体。启动子分析发现CmFER10启动子包含乙烯应答元件ERE、参与胁迫应答的G-box元件和脱落酸响应元件ABRE。(2)通过实时荧光定量PCR的方法,分析两个基因在甜瓜不同组织和不同发育时期果实中的表达量。结果显示,CmHBⅡ-1和CmFER10均在果实的发育过程中差异表达,CmHBⅡ-1基因在果实呼吸跃变期表达量最高;CmFER10基因在果实生长期表达量最高。(3)应用RT-PCR方法克隆了CmHBⅡ-1和CmFER10基因的cDNA,并分别构建了超表达载体和基因编辑载体。采用子房注射法进行遗传转化,获得T1代转化种子并进行阳性率检测,过表达CmHBⅡ-1、基因编辑CmHBⅡ-1、过表达CmFER10、基因编辑CmFER10载体的T1代种子平均阳性率分别为12.6%、11.1%、15.5%、13.3%。从阳性率高的导入果实中随机选取T1代种子,播种于日光温室,取幼嫩叶片,提取DNA,进行PCR检测,对阳性植株进行自交授粉。观察T1代果实的成熟相关表型,发现超表达CmHBⅡ-1的T1代果实有明显早熟表型,与普通甜瓜相比平均早熟4.5天。通过对早熟甜瓜果实果肉进行定量PCR分析发现,ACO1基因表达量是普通对照甜瓜的12倍左右,表明HBⅡ-1在甜瓜果实成熟中具有调控作用。基因编辑CmHBⅡ-1的遗传转化植株的T1代果实呈现晚熟表型,比普通瓜平均晚熟3天。过表达CmFER10的遗传转化植株T1代果实比普通对照甜瓜平均早熟2天。
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