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随着现代肿瘤治疗方案的发展，肿瘤病人的生存率得以提高，也有越来越多非肿瘤疾病(例如系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病)的病人需要接受细胞毒性药物治疗。由于卵巢组织对化疗、放疗损伤的敏感性，这些治疗都可能会造成卵巢功能损害。此外，某些因盆腔良性疾病需要行卵巢切除者，或有家族性卵巢早衰的妇女，都有可能面临着卵巢早衰和生育力的丧失。因此，目前对于卵巢功能保护的需求已日益受到关注。
卵巢组织冷冻保存可用于保存女性生殖功能，卵巢组织冻存的主要优点是标本的收集不需要接受超排卵药物的刺激，不延误肿瘤的治疗，而且，由于始基卵泡的结构和代谢处于静止状态，可以较好地耐受冷冻，因此卵巢组织冻存可以保存大量的始基卵泡。卵巢组织的冷冻方案和效果已经较为稳定，以卵巢组织片的慢速冷冻为主，卵泡存活率可达到70～90﹪。目前，冻融人卵巢组织自体移植的可行性己被两个健康婴儿的出生所证实。自体移植可以分为原位移植和异位移植，原位移植的好处是可以恢复正常的生殖功能和自然受孕，但是一些病人会存在输卵管功能缺陷或盆腔粘连，自然妊娠的机会下降。预期冻融后移植的卵巢组织片只有相对短的寿命，原位移植需要进行腹腔镜手术，反复的移植意味着多次腹腔镜手术，这对病人是一种负担，异位移植可能更合理。异位移植的部位包括皮下、肌肉内、。肾囊下等。皮下移植操作比较简便，重复性容易被接受，易于监测卵泡发育和取卵，有一定的空间适合卵泡生长。皮下移植的可行性已经有大量的研究报道，Lee DM等将猴卵巢组织自体移植在皮下，通过体外受精，在代孕母猴生下了子代，Oktay K等报道移植冻融后人卵巢组织到腹部皮下，从移植物中获取卵子进行体外受精，获得了一个4细胞胚胎，M．Rosendahl等报道冻融人卵巢组织的自体异位移植获得了生化妊娠。影响卵巢组织移植成功率的主要原因之一是移植后缺血再灌注损伤导致大量卵泡丢失。多个研究表明移植后卵巢中卵泡的丢失主要是由于在移植早期缺血缺氧及再灌注损伤所致，而非直接的冷冻损伤，移植后卵巢组织中始基卵泡的丢失可达50～65﹪。因此，有必要找到有效的方法来促进血管生成和减轻缺血缺氧、再灌注损伤。Wang H等在小鼠的研究中认为皮下移植前给予促性腺激素处理可以改善卵泡的存活，可能是由于促进了VEGF基因表达，改善血管生成。但Schnorr J等发现局部给予VEGF并不能改善移植物中始基卵泡的存活，可能是因为外源性VEGF在体内代谢较快的原因。也有学者研究在缺血阶段通过应用抗氧化剂减轻损伤。D．Nugent等认为使用维生素E可以减轻移植在小鼠肾囊下的卵巢皮质块的缺血再灌注损伤，卵泡存活率从45﹪提高到72﹪；但weissman等却并没有发现维生素E能提高卵泡存活率。Kim等报道卵巢组织片在体外缺血时期添加维生素C可以减少缺血损伤，减少卵泡和基质细胞的凋亡。
还原型谷胱甘肽(Redtreed Glutathione，GSH)，是机体内的一种强抗氧化剂，含有较多的巯基，可与体内自由基结合，直接使自由基还原，加速自由基清除，参与细胞的防御机制，包括细胞解毒及细胞的损伤与修复等，可以作为谷胱甘肽过氧化物酶的底物，抑制脂质过氧化，保护细胞膜完整性，维持细胞的正常代谢和功能。临床研究观察证明，GSH作为抗氧化剂和细胞代谢调节剂，在多学科、多病种特别是重症病人救治中是重要的治疗和辅助治疗药物。乌司他丁(Ulinastat-in，UTI)是一种高效广谱的酶抑制剂，对胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶和透明质酸酶等有抑制作用。近年来研究显示，UTI不但能够抑制多种酶的活性，另具有稳定溶酶体膜以及清除氧自由基，抑制多种炎症介质的过度释放，阻断应激时炎症因子与白细胞之间的联系，改善微循环等多种特殊的药理作用，目前在胰腺炎、休克、器官移植等研究中，都显示出了其有效性。
目前对卵巢组织异位移植后血管生成的研究主要是在动物卵巢组织移植方面，大致认为最早在移植后48～72小时内有新生血管形成，但目前尚未有报道对冻融人卵巢组织异位移植血管生成过程的研究。评价卵泡存活率传统而可靠的方法是组织学切片阅片法，但需要专业的技术员和仪器，工作量大；用酶消化分离卵泡法评价卵泡存活率更为方便，可直接把卵泡从卵巢组织中分离出来，结合活性染色，从生物学上评价卵泡的存活情况，目前还未见报道探讨该法用于评价移植后卵巢组织中卵泡存活率的有效性和可靠性。
综上所述，GSH和UTI的抗氧化作用及对缺血再灌注损伤的保护作用已经在多方面得到了验证，但目前尚未有GSH和UTI对冻融人卵巢组织移植的保护作用及冻融人卵巢组织异位移植血管生成过程的报道。本研究以雄性NOD—SCID小鼠作为动物模型，探讨GSH和UTI对冻融人卵巢组织异位移植的卵泡保护作用，及在多个时间点观察移植物的血管生成情况；同时比较酶消化分离卵泡法用于评价移植后卵巢组织的卵泡存活率与传统组织学切片评价法的一致性，探讨有效的卵泡存活率评价方法和卵泡分离法。为人卵巢组织自体移植的临床应用及卵巢组织的卵泡分离、体外培养等进一步研究奠定基础。
材料与方法
1．标本来源
2005年11月至2006年4月期间在中山大学附属第一医院和中山大学附属肿瘤医院进行卵巢切除手术的子宫肿瘤患者6例，年龄31.8±5.7岁(24～38岁)，无化放疗史，按照病人年龄段分为3组：(1)24～27岁，(2)31～32岁，(3)38岁，每年龄段2例病人。
2．实验方法
在全麻下行开腹手术，手术剪活检取得卵巢组织，去除肉眼可见卵泡、黄体及髓质，将卵巢组织切成5X2mm、厚约1mm的组织块，通过慢速冷冻法冷冻保存于液氮中。在移植当天解冻，同一年龄段病人的卵巢组织片随机分为4组：还原型谷胱甘肽组(GSH组)，乌司他丁组(UTI组)，还原型谷胱甘肽+乌司他丁组(GSH+UTI组)，空白对照组。根据不同组别，在解冻液Ⅲ中加入不同药物：GSH组添加浓度为5.O mM的GSH，UTI组添加100U/mL UTI，GSH+UTI组添加5.0 mMGSH和100U/mLUTI；对照组无添加GSH或UTI，在培养箱中平衡30min后，移植在雄性NOD-SCID小鼠背部皮下，从移植当天起连续5天给接受移植的小鼠用药：GSH组给予肌肉注射GSH2.0g/kg；UTI组给予尾静脉注射UTI100，000U/kg；GSH-UTI组同时给予GSH2.0g/kg和UTI100，000U/kg；对照组给予肌肉注射生理盐水0.1ml，均为每天1次。分别在移植后第1天、3天、7天、14天、28天、56天和85天回收移植物，一半用于组织学检查和免疫组化检测，一半用于酶消化分离卵泡。
(1) 组织学检查以4μm连续切片，HE染色，每隔16μm阅片，光镜下计算形态正常的卵泡数及测量卵泡直径，评价卵泡存活率和各阶段卵泡的比例。
(2) 免疫组化采用具有种属特异性的CD34和CD31抗体对血管进行标记，计算微血管密度(MVD)，观察移植物中人血管及新生的小鼠血管随时间变化的趋势，以及用VEGF抗体检测VEGF蛋白在移植物中的表达，VEGF的表达用Histochemical Score(HS)进行半定量评价。
(3) 酶消化分离卵泡法是将移植物剪碎至小块后置入胶原酶I溶液中消化，在显微镜下回收卵泡，测量卵泡直径并行活性荧光染色，计算卵泡存活率和各阶段卵泡的比例。
结果
1．组织学检查结果解冻后卵巢组织的卵泡存活率为84.4±5.7﹪，-移植后各组的卵泡存活率较移植前明显下降，移植后各时间点间的卵泡存活率有统计学差异(p=0.018)，在移植后第1～3天达到低值(p=0.045)。各时间点平均卵泡存活率：GSH组为50.4±6.1﹪，UTI组为53.5±9.2﹪，GSH+UTI组为55.2±6.7﹪，均高于对照组(40.1±9.4﹪)(p=0.022)。
2．免疫组化检测结果抗人CD34标记的血管MVD在移植后逐渐下降(p=0.024)，组别之间没有显著差别(p=0.81)。
3．酶消化分离卵泡结果各移植时间点之间卵泡存活率有明显差异(p=0.0001)，在移植后第3～7天达到低值(p=0.0004)，各时间点平均卵泡存活率：GSH组为86.0±3.4﹪，UTI组为80.6±7.0﹪，GSH+UTI组为82±9.0﹪，与对照组(78,1±7,3﹪)比较没有统计学差异(p=0.114)。
结论
1．本研究提示GSH和UTI均可有效改善冻融人卵巢组织在雄性NOD-SCID小鼠皮下移植的卵泡存活率；
2．冻融人卵巢组织在没有外源性促性腺激素刺激的作用下，可在雄性NOD-SCID小鼠皮下移植部位启动卵泡生长，形成早期窦卵泡，提示皮下移植可使卵泡发育潜能得到保存；
3．冻融人卵巢组织在雄性NOD-SCID小鼠皮下移植后可快速地建立血供，VEGF的表达在移植早期明显增加；
4．酶消化分离卵泡法可有效分离到存活率高的窦前卵泡，但用于评价移植后卵巢组织中的卵泡存活率会存在偏差。