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研究背景心肌梗死(myocardial infarction,MI)是严重威胁人类健康的重要疾病之一。MI在欧美国家最为常见,在美国,每年约有0.05%的人口发生MI,且MI在中国的发病率近年来呈现出明显的上升趋势。MI危害在于可导致休克、心力衰竭、室壁瘤及心律失常等一系列威胁生命的严重并发症,尤以心律失常中的恶性室性心律失常(ventricular arrhythmias,VAs)的危害最为严重,是MI患者恢复期致死的主要原因之一。VAs的发生与MI后心脏交感神经的过度再生及重构有关。交感神经和迷走神经共同支配心脏活动,任何原因导致的心脏电生理活动的不稳定(如交感神经的活动占明显优势或迷走神经活动被抑制),均可导致临床中VAs的发生,进而威胁患者生命。日前有相关研究表明,以交感神经过度再生为特点的心脏自主神经重构为MI早期VAs发生的重要因素,因此,探讨MI后交感神经再生的分子机制可为MI后VAs的治疗提供新的理论依据。核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB),作为已知的重要的核转录因子,参与神经细胞发育、生长和凋亡过程。我们前期的研究发现,MI后心肌组织中NF-κB的激活是心脏交感神经再生过程中的关键环节,抑制心肌组织中的NF-κB活性,可显著抑制MI后交感神经再生,并改善MI后心脏交感神经重构。但我们前期对心梗后神经再生及心律失常的研究仅局限于心脏本身,对于心梗后心血管活动调控的上游-中枢神经系统对其的调节机制-知之甚少。在大脑中有诸多心血管调控中枢(即中枢神经系统中的神经元集中的部位,这些神经元与控制心血管的活动相关),下丘脑在调节心血管活动中起重要作用,其中下丘脑室旁核(hypothalamic paraventricular nucleus,PVN)是心血管活动和自主神经系统的调控中枢,MI后PVN的前交感神经元中自发动作电位频率增加,导致了心脏交感神经激活,这表明,PVN可通过调节交感神经的兴奋,进而调节MI大鼠的心血管活动。近年来在高血压模型大鼠及心衰大鼠模型中,关于PVN对交感神经活性的影响的研究较为多见,而在心梗大鼠中干预PVN对交感神经重构的作用探索甚少。所以我们设想,靶向调控PVN内的NF-κB信号通路,可改善MI后心脏交感神经再生及恶性心律失常发生率。研究目的本研究旨在探讨,从PVN水平靶向抑制NF-κB信号通路,探究其对MI后心脏交感神经再生、恶性心律失常发生率的影响。研究方法实验步骤一:为明确MI后PVN内NF-κB表达的动态变化,我们将30只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(260-280g左右)行左冠状动脉前降支结扎建立MI模型,根据取材时间分为5组:MI-0d,MI-1d,MI-3d,MI-5d,MI-7d,分别为MI后立即取材,MI后]天、3天、5天及7天取材。将取出的PVN组织利用Western Blot实验检测MI后NF-κB及IκBα的动态表达变化。实验步骤二:为探究PVN内NF-κB与白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的关系,我们设计了如下实验,将18只SD大鼠随机分为3组,A:空白组(naive组),该组动物只麻醉不做其他处理;B:内毒素组(LPS组),该组动物麻醉后,通过动物脑立体定位仪颅顶钻孔,后经微量注射器于两侧PVN内给予LPS(12.5μgLPS溶于 50nl 生理盐水中),每侧 50nl;C:LPS+gevokizumab 组(LPS+gevo 组),纳入该组的大鼠先行两侧PVN内LPS注射,方法及剂量同B组,30分钟后,进行 IL-1β 抑制剂 gevokizumab(50nl 生理盐水含 10μg 的 gevokizumab)PVN 内注射。2小时后取材,完整移出脑组织进行后续Western Blot实验。实验步骤三:为了探究PVN中NF-κB信号通路在MI后交感神经重构的作用及机制,我们将SD大鼠麻醉后通过脑立体定位仪颅顶钻孔,随后放置并固定不锈钢PVN双套管,恢复7天后被随机分为四组:A:假手术+PBS组,SD大鼠行左冠状动脉前降支穿线,但不结扎。PBS通过套管内给药,连续7天,直至取材。B:假手术+吡咯烷二硫氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)组,手术及PDTC给药方法同前。C:MI+PBS组,大鼠左冠状动脉前降支结扎建立MI模型,PBS给药方法及时间同前。D:MI+PDTC组,同样先结扎左冠状动脉前降支建模,随后通过套管PVN内给予PDTC靶向抑制NF-κB活性,连续7天,直至取材。MI后第7天,行心室压力容积实验来检测大鼠的血流动力学状态及程序电刺激实验检测心律失常易感性,实验结束后取出脑组织和心肌组织,一部分脑组织分离出其中的PVN行Western Blot实验检测NF-κB信号通路相关蛋白水平表达,另一部分行免疫组织化学染色,检测Fra-LI表达水平。心肌组织分离出左心室梗死灶周心肌组织,行免疫荧光实验检测梗死灶周的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)及生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)两种神经纤维的阳性表达来分析交感神经再生情况。研究结果1、MI3天后PVN中的NF-κB水平显著升高,至第7天时表达较前略有降低,但仍维持在较高水平,提示,MI后PVN内的NF-κB通路被激活。2、在单独行LPS刺激组的大鼠的PVN中,NF-κB、IL-1β及神经生长因子(nerve growth factor,NGF)蛋白表达水平升高,给予IL-1β抑制剂后,NF-κB仍保持在较高水平,但IL-1β及NGF蛋白表达水平较单独LPS组显著降低,提示IL-1β参与PVN中NF-κB信号通路。3、MI后PVN中的NF-κB/IL-1β信号通路被激活,这一现象可被PVN内靶向给予NF-κB抑制剂PDTC而阻断。MI+PDTC组与MI+PBS组相比,Western Blot实验提示PVN内NF-κB、IL-1β及NGF蛋白表达水平降低;免疫组织化学实验提示PVN中交感活性也有所减弱;免疫荧光实验提示心肌梗死灶周的TH及GAP-43 阳性神经纤维密度降低;程序电刺激实验提示心律失常易感性的降低。研究结论综上所述,我们的研究数据表明,靶向调控PVN中NF-κB信号通路可通过下调IL-1β及NGF蛋白表达水平来改善MI后的交感神经再生。这一结果提示靶向调控PVN中的NF-κB可成为改善MI后心脏交感神经重构及降低心律失常发生率的新的靶点。