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近30年来,随着转基因动物技术的迅猛发展,不仅给农业和生物医药领域带来了革命性的变化,同时也引起了一系列相关的问题,如转基因动物及其产品的食用安全问题、伦理道德问题以及对生态环境的影响等。这些问题迫使世界各国都在加强对转基因动物的管理工作,制定完善的有关转基因动物及其食品安全的管理法规及标识制度。然而,这些法规制度的制定需要有健全的转基因动物检测体系来提供技术保障。本文主要从核酸水平对小鼠外源转基因成分检测技术进行了研究。
1)转基因阳性鼠的检测采用一步法抽提鼠尾基因组DNA,得到OD值在1.7-1.9之间的高质量DNA,首先用普通PCR检测得到阳性鼠,然后通过Southern杂交进行验证。结果显示:4个转基因后代中3个检测为阳性,一个没有检测到信号,但后面经过荧光定量PCR和TAIL-PCR检测证明,其也为转基因阳性。
2)外源基因结构检测建立多重PCR技术,在同一管中同时扩增一个内源基因和3个外源基因片段(包括外源目的基因、启动子和终止子),扩增得到特异性好的4重PCR结果。表明此技术用于转基因动物检测可以大大提高工作效率和速度。
3)整合位点检测根据插入外源基因5端序列设计特异性引物和小鼠基因密码子的偏好性设计随机引物,用TAIL-PCR检测4个转基因founder小鼠F1代阳性小鼠的外源基因插入位点。得出2个转基因小鼠的外源基因插入位点,分别插入在10号染色体的Sash1基因的第10内含子上和6号染色体Nxph1和AA545190基因间。
4)拷贝数检测选择小鼠单拷贝管家基因B2M作为内源基因,根据B2M和外源基因特异序列,利用BeaconDesigner2.0软件分别设计引物和探针,建立TaqMan实时荧光定量PCR技术。结果显示:外源基因TMEM66和内源基因B2M的real-timePCR的扩增标准曲线的相关系数分别为0.990和0.985,可以用于外源基因拷贝数的检测。计算得出11、49、52和55founder小鼠的外源基因拷贝数分别为623、3、22和10。