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神经生长因子（nerve growth factor，NGF）是一种神经营养多肽分子，属于神经营养家族的一员。它以旁分泌形式作用于其高亲和力受体——pp140c-trk，从而在交感神经、感觉神经和中枢神经系统的生长发育、维持和再生中发挥重要作用。在过去的研究中，人们对于神经生长因子促进交感神经和感觉神经的生长发育给予了较高的关注，虽然还有其他信号传导通路，但蛋白的磷酸化在这一过程中起到了关键作用。pp140c-trk是一种酪氨酸激酶，当接受NGF作用时可发生自身磷酸化，进而激活其下游的一系列分子反应并导致多种丝／苏氨酸激酶的活化，其中包括细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）的活化。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12细胞由于表达NGF受体而成为研究生长因子特性的常用细胞模型，在神经生长因子作用下，PC12细胞可发生神经细胞样分化。为探讨NGF在诱导PC12细胞分化时ERK及其他相关蛋白的作用机制，本文主要从以下几个方面进行研究： 1．建立NGF诱导PC12细胞分化的细胞模型，应用倒置相差显微镜观察及显微镜测微尺来鉴定PC12细胞的分化并确定NGF使用剂量。 实验结果显示：未经处理的PC12细胞呈圆形、短梭形或三角形，直径6—8μm，有的细胞两极有短突起，但长度不超过2μm。瘤细胞生长迅速。经NGF处理PC12细胞12 h，即可观察到明显细胞突起；24 h后可见细胞体积明显增大，突起数目增多；培养2～3天后细胞突起继续伸长。处理48 h时，可见PC12细胞出现多个突起，其中一个较长和粗，最长可达80μm，其上还可见小的突起，类似神经元轴突。除轴突样突起外，细胞还伸出多条其他突起，有长有短，突起数目不等。分别以10 μg／L，20 μg／L和50 μg／L的NGF处理PC12细胞，可见随NGF剂量的升高，细胞的直径、最长突起长度和突起数目均增大或增多。表明细胞在NGF处理后出现的神经样改变呈现良好的NGF剂量和时间相互关系。以50μg／L的NGF作为以后实验用剂量。 2．观察NGF对PC12细胞ERK总蛋白、磷酸化的ERK蛋白水平的影响，并用MEK抑制剂UO 126探讨ERK蛋白的活化在PC12细胞分化中的影响。 实验结果显示:细胞总ERK蛋白水平在NGF作用前后无明显改变;磷酸化的ERK蛋白水平在未处理的PC12细胞中几乎检测不到，而在NGF作用5 min时，即可见磷酸化的ERK蛋白水平显著增高并达到峰值，持续lh左右，Zh时降低至初始水平。另一方面，不同浓度的NGF（5协留L，10协g/L，20林g/L和50件g/L）处理PC12细胞10 min后收集细胞样品，免疫印迹结果显示细胞总ERK蛋白水平在NGF作用前后仍无明显改变;磷酸化的ERK蛋白水平则随NGF使用浓度的加大而增高，显示良好的剂量依赖性。 MEK抑制剂UO126可通过阻断ERK通路上游分子MEK的活化来抑制ERK的磷酸化。分别在50件g/L的NGF作用pC12细胞前10 min，作用后20 min、50而n和80 min加入10娜01/L的Uo126，收集NGF作用20 min、30 min、 lh和Zh时间点的细胞样品，免疫印迹方法检测磷酸化的ERK蛋白水平。结果可见ERK蛋白的活化随着UO126的加入而立即终止。应用倒置相差显微镜及显微镜测微尺观察各时间点UO 126处理组在NGF作用于PC12细胞48h后的细胞形态时，发现NGF作用前加入UO 126处理组细胞仍以圆形和三角形居多，细胞突起不明显;而NGF作用后加入U0126处理组细胞胞体较大，突起较多，细胞的直径、突起的长度和数目可随U0126作用时间的降低而增加。3.以低血清浓度培养基处理的PC12细胞为对照，观察NGF对PC12细胞P53及PZI蛋白水平的影响，并应用U0126探讨ERK的活化与P53及PZI蛋白的相互关系。 实验结果显示:1%FBS的1 640培养基和50件叭的NGF分别处理PC12细胞48h后用流式细胞仪检测细胞周期，结果表明两种处理组细胞均发生Gl期阻滞。免疫印迹分别检测其P53及P21蛋白的表达，结果发现NGF处理组3h时即可观察到P53表达的增高，至12h达到峰值，24h后开始回落;NGF作用12h时可见PZI蛋白水平升高，并持续至48h。低血清处理组12h时可观察到P53蛋白的表达，并持续至48h;而PZI蛋白水平在含1%FBS的1 640培养基作用前后无明显改变。如果用含1%FBS的1 640培养基预处理PC12细胞16h后P53蛋白水平有显著表达，此时加入NGF，可见NGF作用lh时P53蛋白水平显著降低，Zh时仍不见改变，3h后可见其蛋白水平升高，并持续至12h。 另一方面，Uol 26对于NGF诱导的P53的表达有明显的抑制作用，分别在50林g/L的NGF作用PC12细胞前10 min，作用后20 min、50 min和80 min加10娜ol几的UO 1 26，收集NGF作用6h的细胞样品，免疫印迹检测P53蛋白的表达发现完全抑制ERK的活性时P53蛋白的表达也被完全抑制，随着ERK活化时间的延长，P53蛋白的表达明显上升。 结论:在NGF作用下PC12细胞可发生神经样细胞分化，ERK蛋白的活化参与了NGF诱导的PC12细胞的分化。然而活化的ERK蛋白可能只在PC12细胞分化的早期发挥重要作用。运用MEK抑制剂U0126，通过即时完全抑制ERK蛋白的活化来进一步探讨ERK蛋白的作用，结果进一步证实ERK蛋白参与了PC12细胞的分化，并在细胞分化的早期发挥重要作用。 本研究表明，在NGF