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奶牛乳房炎是主要由病原微生物感染引起奶牛乳腺组织产生的炎症。该病在奶牛场普遍存在,引起巨大的经济损失,严重危害奶牛养殖业的健康发展。根据临床症状奶牛乳房炎通常可分为临床型和隐性型,其中隐性乳房炎发病率高而且乳房和乳汁无肉眼可见变化,很容易被忽视,因而造成的潜在损失更大。目前,治疗奶牛隐性乳房炎的药物仍然以抗生素为主,但是随着耐药菌株的不断出现和人们对食品安全问题的日益重视,近年来寻找非抗生素方法疗奶牛隐性乳房炎成为研究热点。因此,本文重点研究具有免疫调节作用的白术多糖提取物对奶牛隐性乳房炎的治疗作用和初步机理,以期为临床用药提供新的思路。1白术多糖的分离纯化及其油乳剂的制备目的:提取并纯化白术多糖(RAMP),将其制备成物理性状稳定、粘滞度适宜注射的油乳剂。方法:采用水提醇沉法从中药白术中提取粗多糖,对其进行Sevag法脱蛋白和透析,随后采用苯酚-硫酸法对真空冷冻干燥后的白术多糖进行总糖含量的检测;采用菜籽油和乳化剂(吐温80及司班80)在高速剪切力的作用下将RAMP制备成油乳剂,对其进行乳剂类型鉴定、稳定性及粘滞度分析和粒径大小及分布的检测。结果:本研究中分离纯化的RAMP为非淀粉、非还原性多糖,不含蛋白质和核酸,得率为6.58%,总糖含量为89.63%;制备的白术多糖油乳剂(R4AP-O)为稳定性良好和粘滞度适宜的水包油(O/W)型普通乳剂,Z均粒径为1130nm。2白术多糖油乳剂治疗奶牛隐性乳房炎的研究目的:探究白术多糖油乳剂对奶牛隐性乳房炎的治疗效果。方法:将RAMP-O皮下注射到健康奶牛的双侧乳房淋巴结部位,观察注射部位的变化,连续三天采集混合奶样进行体细胞计数分析,评价其对奶牛乳房的刺激性;在高体细胞(SCC≥ 50万/mL)奶牛的患侧或双侧乳房淋巴结部位皮下注射不同剂量的RAMP-O,对照组不作处理,于用药前和用药后1、2、3周采集乳区奶或混合奶样进行SCC和乳清N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活性的检测,评价其对乳区奶或混合奶SCC和NAGase活性的影响;在隐性乳房炎奶牛的双侧乳房淋巴结部位分别注射RAMP-O,对照组不作处理,于用药前和用药后1、2、3周采集乳区奶样进行SCC、NAGase活性检测和奶样细菌分离鉴定,于用药后一个月采集混合奶样送往DHI检测中心进行SCC和乳脂及蛋白含量的检测,评价其对SCC、NAGase活性、感染细菌乳区数和牛奶品质的影响;在规模牛场高体细胞(SCC≥40万/mL)奶牛的双侧乳房淋巴结部位分别注射RAMP-O,对照组不作处理,用药后一个月采集混合奶样送往DHI检测中心进行SCC分析,评价RAMP-O对牛群SCC的影响。结果:乳房淋巴结部位皮下注射RAMP-O无可见不良反应;患侧或双侧乳房淋巴结部位皮下注射RAMP-O可显著降低高体细胞奶牛乳区奶或混合奶SCC和NAGase活性;双侧乳房淋巴结注射RAMP-O能够显著降低患隐性乳房炎奶牛混合奶和乳区奶SCC、乳区奶NAGase活性,减少感染细菌的乳区数,且对日产奶量和牛奶品质(乳脂率和蛋白率)无不良影响;在规模牛场高体细胞奶牛的双侧乳房淋巴结部位注射RAMP-O能够降低牛群的牛奶SCC。3白术多糖对奶牛乳房淋巴结淋巴细胞的免疫调节作用目的:探究RAMP对奶牛乳房淋巴结淋巴细胞的体外免疫调节作用。方法:采用水提醇沉法从中药白术中提取粗多糖,对其进行木瓜蛋白酶和Sevag法联合脱蛋白及透析,获得白术总多糖(RAMPtp)和三种白术多糖组分(RAMP60、RAMP70和RAMP80),采用红外光谱(FTIR)和MTT法分别比较它们的结构特征和对淋巴细胞增殖的刺激活性。进一步对RAMPtp的分子量、单糖组成、化学位移和超微结构进行检测,并分析RAMPtp对乳房淋巴结淋巴细胞内Ca2+浓度、细胞周期和细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL17A和TGF-β1)mRNA表达水平的影响。采用溴化氰激活的方法制备荧光素标记的白术总多糖(flRAMPtp),并以其为工具探究RAMPtp与淋巴细胞的结合作用。结果:四种多糖具有不同的红外光谱特征,在其中三种可溶性白术多糖(RAMP70、RAMP80和RAMPtp)中,仅RAMPtp能促进乳房淋巴结淋巴细胞增殖。凝胶渗透色谱(GPC)结果表明RAMPtp是数均分子量为1867的多糖;高效液相色谱(HPLC)结果表明RAMPtp主要由葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖组成,质量百分比分别为60.67%,14.99%,10.61%,8.83%和4.90%;核磁共振(NMR)氢谱和碳谱结果表明RAMPtp同时含有α和β构型,并且可能主要由1,3-linked β-D Galp和1,6-linkedβ-D Galp残基连接;扫描电镜(SEM)结果表明RAMPtp为无定型结构。RAMPtp能够与淋巴细胞受体结合,增加细胞内Ca2+浓度,促进淋巴细胞由G0/G1期进入S期和G2/M期,上调细胞因子IFN-γ和IL-17AmRNA的表达,下调IL-4和TGF-β1 mRNA 的表达。4白术总多糖刺激后奶牛乳房淋巴结淋巴细胞的转录组测序研究目的:探讨RAMPtp对奶牛乳房淋巴结淋巴细胞的体外分子作用机制。方法:采用RNA-Seq技术对RAMPtp刺激后的淋巴细胞进行转录组测序分析,并对测序结果进行差异表达、GO(Gene Ontology)功能和 KEGG(Kyoyo Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集等方面的生物信息学分析。结果:RAMPtp刺激淋巴细胞后鉴定出243个显著的差异表达基因,其中189个上调,54个下调;-GO富集分析发现细胞成分(cell part),细胞进程(cellular process)以及结合(binding)是占据前三位的GO条目;KEGG通路富集分析鉴定出9条典型的通路,其中 Cytokine-cytokine receptor interaction,Jak-STAT signaling pathway 以及Chemokine signaling pathway富集的差异表达基因数量较多。综上所述,本研究从中药白术中提取多糖成分RAMP,制备成植物油乳剂RAMP-O。在奶牛乳房淋巴结部位皮下注射RAMP-O能够降低牛奶SCC和NAGase活性,减少感染细菌的乳区数,且对奶牛无可见不良影响。体外试验表明,在不同组分的白术多糖提取物中,仅RAMPtp对奶牛乳房淋巴结细胞有刺激活性。进一步采用GPC、HPLC、NMR和SEM对RAMPtp进行了结构表征并发现RAMPtp可与奶牛乳房淋巴结淋巴细胞结合,增加细胞内Ca2+浓度,促进淋巴细胞进入S期和G2/M期,上调细胞因子IFN-y和IL-17AmRNA的表达,下调IL-4和TGF-β1 mRNA的表达。最后对RAMPtp刺激后的奶牛乳房淋巴结淋巴细胞进行转录组测序分析,鉴定出243个显著的差异表达基因,47个显著富集的.GO条目和9条显著富集的典型通路。据此推测,RAMP-O对奶牛隐性乳房炎的治疗作用可能和RAMPtp对奶牛乳腺的免疫调节有关。