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骨骼肌是维持机体运动的重要器官，也是生物体含量最多的组织，在人类中占据了40％的含量。骨骼肌容易受到损伤，已知的外界因素如:低温、穿刺、电感、过度运动;或疾病因素如:肌萎缩症、神经性病变等都会对骨骼肌造成损伤。如果不及时进行修复，则会造成运动障碍、肌肉大量缺失甚至死亡等严重结果。肌肉星型细胞(satellite cell)的存在使得骨骼肌具有自我修复的能力，星型细胞经过自我扩增后经历成肌分化、融合形成新生的肌肉纤维。有研究表明microRNAs在成肌分化中起到了关键的作用。MicroRNA-17-92家族是一群高度保守，功能繁复的非编码RNAs，其功能涉及到肿瘤发生、迁移、毒性作用等各个方面。近年来，有研究表明miR-17-92家族参与肌肉成肌分化过程，然而，其各个家族成员在该过程中的具体作用及相关机制尚不明确。本研究通过对C2C12细胞和MDSCs(primary bovine skeletal muscle-drived satellite cells)细胞处理miR-17-92家族不同microRNAs来探究它们在成肌分化中的调节作用及相关机制，具体结论如下:
1、miR-17和miR-20a促进C2C12和MDSCs细胞成肌分化。
对培养的C2C12和MDSCs细胞转染人工合成的miR-17-92家族成员microRNA mimics，在分化条件(DM)和增殖条件(GM)下，探究了各成员对成肌分化的影响。结果证实miR-17和miR-20a显著促进两种细胞分化，而miR-18a、miR-19和miR-92a对分化无显著影响。此外，miR-18a抑制剂能够促进细胞成肌分化。
2、miR-17和miR-20a是通过经典的RISC沉默复合体途径促进成肌分化。
利用人工合成的siRNAs干涉AGO2和GW182两个RISC的关键蛋白，并在GM的条件下进行成肌分化实验，免疫染色结果表明，在转染miR-17和miR-20a的同时转染siAG02和siGW182能够显著性抑制分化效果，MYHC蛋白的表达量降低。但单独的miR-17和miR-20a仍能促进分化，结果表明，miR-17和miR-20a是通过经典的microRNA-RISC沉默复合体途径来促进成肌分化的。
3、miR-17和miR-20a的靶基因筛选及验证。
利用RNA-seq测序技术结合生物信息分析筛选出Ccnd2、Jak1和Rhoc为miR-17和miR-20a下游的靶基因，并通过实时定量检测、Western Blot和双荧光素酶报告系统确定了靶基因的真实、可靠性。进而在GM和DM条件下验证了靶基因对C2C12细胞促进分化的效果。结果表明，在DM条件下siCcnd2、siJak1和siRhoc都能促进成肌分化，GM条件下siCcnd2、siJak1有促进作用，而siRhoc作用不显著。
4、miR-19抑制miR-17的致死效应，并且miR-17+19组合进一步促进成肌分化。
MiR-17在促进成肌分化的同时造成了致死效应，但miR-19的添加抑制了miR-17造成的细胞死亡。通过转录组测序，发现miR-19能够靶向抑制Pten、Socs3和Trifaip3，激活AKT和ERK信号通路抑制凋亡。同时，通过转录组比对、MYHC免疫染色等试验发现，miR-19和miR-17的组合进一步的促进了C2C12的成肌分化作用。并且促进了肌细胞形成肌管。
5、miR-17+19促进了小鼠胫前肌损伤修复进程。
将人工设计的shRNA-17和shRNA-19的组合进行病毒包被，超速离心浓缩后注射进提前用Bacl2处理的小鼠胫前肌中，分别在第0、1、3、5、10天取出肌肉组织进行HE和免疫染色。结果表明，相比于空白对照组，microRNAs处理组形成了数目更多、横截面积更大的新生肌纤维，shRNA-17+19显著地促进了肌肉损伤修复的进程。
综上所述，本论文探讨了miR-17-92家族成员对成肌分化的调节作用，筛选出了miR-17+19的最佳促分化组合。同时验证了miR-17促进分化以及miR-19促进存活的靶基因机制，并进一步探索了miR-17+19促进肌肉损伤修复的能力，对肌肉损伤、肌萎缩等疾病提供了新的治疗策略。
1、miR-17和miR-20a促进C2C12和MDSCs细胞成肌分化。
对培养的C2C12和MDSCs细胞转染人工合成的miR-17-92家族成员microRNA mimics，在分化条件(DM)和增殖条件(GM)下，探究了各成员对成肌分化的影响。结果证实miR-17和miR-20a显著促进两种细胞分化，而miR-18a、miR-19和miR-92a对分化无显著影响。此外，miR-18a抑制剂能够促进细胞成肌分化。
2、miR-17和miR-20a是通过经典的RISC沉默复合体途径促进成肌分化。
利用人工合成的siRNAs干涉AGO2和GW182两个RISC的关键蛋白，并在GM的条件下进行成肌分化实验，免疫染色结果表明，在转染miR-17和miR-20a的同时转染siAG02和siGW182能够显著性抑制分化效果，MYHC蛋白的表达量降低。但单独的miR-17和miR-20a仍能促进分化，结果表明，miR-17和miR-20a是通过经典的microRNA-RISC沉默复合体途径来促进成肌分化的。
3、miR-17和miR-20a的靶基因筛选及验证。
利用RNA-seq测序技术结合生物信息分析筛选出Ccnd2、Jak1和Rhoc为miR-17和miR-20a下游的靶基因，并通过实时定量检测、Western Blot和双荧光素酶报告系统确定了靶基因的真实、可靠性。进而在GM和DM条件下验证了靶基因对C2C12细胞促进分化的效果。结果表明，在DM条件下siCcnd2、siJak1和siRhoc都能促进成肌分化，GM条件下siCcnd2、siJak1有促进作用，而siRhoc作用不显著。
4、miR-19抑制miR-17的致死效应，并且miR-17+19组合进一步促进成肌分化。
MiR-17在促进成肌分化的同时造成了致死效应，但miR-19的添加抑制了miR-17造成的细胞死亡。通过转录组测序，发现miR-19能够靶向抑制Pten、Socs3和Trifaip3，激活AKT和ERK信号通路抑制凋亡。同时，通过转录组比对、MYHC免疫染色等试验发现，miR-19和miR-17的组合进一步的促进了C2C12的成肌分化作用。并且促进了肌细胞形成肌管。
5、miR-17+19促进了小鼠胫前肌损伤修复进程。
将人工设计的shRNA-17和shRNA-19的组合进行病毒包被，超速离心浓缩后注射进提前用Bacl2处理的小鼠胫前肌中，分别在第0、1、3、5、10天取出肌肉组织进行HE和免疫染色。结果表明，相比于空白对照组，microRNAs处理组形成了数目更多、横截面积更大的新生肌纤维，shRNA-17+19显著地促进了肌肉损伤修复的进程。
综上所述，本论文探讨了miR-17-92家族成员对成肌分化的调节作用，筛选出了miR-17+19的最佳促分化组合。同时验证了miR-17促进分化以及miR-19促进存活的靶基因机制，并进一步探索了miR-17+19促进肌肉损伤修复的能力，对肌肉损伤、肌萎缩等疾病提供了新的治疗策略。