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阴茎海绵体纤维化疾病如阴茎硬结症(Peyronie’s disease)可导致海绵体勃起组织中平滑肌和结缔组织比例失衡,同时损害白膜的容韧性,造成勃起时出现阴茎弯曲和不同程度的性功能障碍,甚至不能勃起。目前具体病因及发病机制不明,尚无实用的动物模型和有效的治疗手段。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)在阴茎海绵体纤维化中扮演着非常重要的角色。注射外源性TGF-β1,可促进阴茎海绵体和白膜纤维化。但外源性生长因子纯化过程复杂,价格昂贵,半衰期短,需大剂量反复使用,因而限制了其应用。随着分子生物学的发展,使人们可利用转基因技术将编码生长因子的基因导入细胞,其优点是转基因细胞可在局部持续表达高生物活性的内源性生长因子,调控其自身增殖分化,而且其表达产物经过翻译后修饰过程,可更有效地与靶细胞表面受体结合,获得最佳效应所需要的剂量大大地减少。本实验拟将构建真核表达载体重组质粒pcDNA3.1(+)-hTGF-β1,采用脂质体转染阴茎海绵体组织诱导其纤维化,建立大鼠阴茎海绵体纤维化的动物模型。中药氧化苦参碱对器官纤维化疾病具有良好效果,但国内外尚未见报道其在防治阴茎海绵体纤维化中的作用。本文在建模的基础上,将进一步研究中药氧化苦参碱防治阴茎海绵体纤维化的作用机制。第一部分人转化生长因子-1(hTGF-β1)基因真核表达载体的构建目的:构建人转化生长因子-1基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-hTGF-β1。方法:对质粒pcDNA3.1(+)和pAdlox-hTGF-β1进行双酶切、胶回收、连接、转化、筛选等基因克隆方法,构建pcDNA3.1(+)-hTGF-β1真核表达载体。采用双酶切鉴定、PCR扩增目的基因片段,并进行基因测序。结果:双酶切、PCR扩增及基因测序结果显示,所构建的真核表达载体中含有hTGF-β1基因与预期的目的基因一致。结论:成功构建pcDNA3.1(+)-hTGF-β1真核表达载体。第二部分人转化生长因子-1(hTGF-β1)基因在阴茎海绵体平滑肌细胞中的表达目的:研究人转化生长因子-1基因真核表达载体pcDNA3.1(+) -hTGF-β1在SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞(corpus cavernosum smooth cells, CCSMCs)中的表达。方法:采用组织块培养法原代培养SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞;脂质体转染方法将基因克隆构建的pcDNA3.1(+)-hTGF-β1真核表达载体转染SD大鼠CCSMCs,G418筛选获得稳定转染的细胞;MTT法检测其增殖活性,FCM检测细胞凋亡,RT-PCR、ELISA、Western blot和免疫细胞化学检测其表达效率。结果:pcDNA3.1(+)-hTGF-β1能在真核细胞CCSMCs中成功表达,转染效率可达40～50%;RT-PCR、ELISA、免疫细胞化学证实,hTGF-β1基因在CCSMCs中至少可持续表达4w,细胞浆内及细胞外基质中hTGF-β1 mRNA及蛋白水平均增加;MTT、FCM检测提示转染hTGF-β1基因可促进CCSMCs增殖,未见细胞凋亡发生。结论:重组质粒pcDNA3.1(+)-hTGF-β1在CCSMCs中可持续稳定表达hTGF-β1,具有促细胞增殖的作用。第三部分阴茎海绵体纤维化动物模型的建立目的:转化生长因子-β1(TGF-β1)已经证实在阴茎海绵体纤维化中扮演重要的角色,最终导致勃起功能障碍。本研究目的是为建立阴茎海绵体纤维化的有效的动物模型,进一步阐明TGF-β1信号通路与海绵体纤维化的联系。方法:采用脂质体转染法将hTGF-β1基因导入雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠的阴茎海绵体内,以制作纤维化模型。将36只大鼠随机分成3组:对照组pcDNA3.1(+)组、造模组rhTGF-β1组(注射重组人TGF-β1 200ng/0.1ml×3d)和pcDNA3.1(+)-hTGF-β1组。应用RT-PCR检测海绵体纤维化动物模型的海绵体组织中hTGF-β1、CTGF及FN mRNA的表达;免疫组织化学方法检测hTGF-β1蛋白在海绵体组织内的表达和分布;HE染色、苦味酸-天狼星红偏振光法对海绵体组织中纤维化病变、胶原的性质及分布特点进行观察;罂粟碱诱导勃起下阴茎海绵体内测压(ICP)检测动物模型的勃起功能。结果:RT-PCR显示,转染pcDNA3.1(+)-hTGF-β1组hTGF-β1 mRNA表达可持续至注射后4w。免疫组织化学方法可见转染后不同时期hTGF-β1在海绵体组织内均有不同程度的表达。苦味酸-天狼星红染色和偏振光法可确定海绵体纤维化组织胶原类型、分布、排列与含量。偏振光显微镜下可见,转染pcDNA3.1(+)-hTGF-β1组注射4w后在海绵体组织内出现大量纤维化,与rhTGF-β1组造模效果相同,而转染pcDNA3.1(+)组未见纤维化的组织学证据。随海绵体纤维化程度的不同清晰地显示嗜酸性胶原蛋白纤维束,其中Ⅰ型胶原纤维(ColⅠ)为粗大明亮的黄或红色纤维,显示很强的双折光性;Ⅲ型胶原纤维(ColⅢ)为绿色细纤维,呈疏网状,显示弱的双折光。经图像分析,pcDNA3.1(+)-hTGF-β1组14天时ColⅠ占(10.58±2.33)%,ColⅢ占(45.13±2.67)%;28天时ColⅠ占(50.12±2.58)%,ColⅢ占(38.14±1.66)%。罂粟碱诱导勃起时,阴茎海绵体内测压(ICP)显示,pcDNA3.1(+)-hTGF-β1组的最大海绵体内压(MAP)显著低于另外两组。结论:转染pcDNA3.1(+)-hTGF-β1可有效地造成大鼠阴茎海绵体纤维化。这一新型的动物模型的建立能够更进一步明确阴茎海绵体纤维化的病理进程与TGF-β1信号通路的关系,并从该信号通路中寻求新的治疗手段。第四部分氧化苦参碱干预阴茎海绵体纤维化疾病的实验研究目的:观察氧化苦参碱(Oxymatrine, OM)防治大鼠阴茎海绵体纤维化的疗效并探讨其作用机制。方法:采用第三部分实验方法建立大鼠阴茎海绵体纤维化模型,观察氧化苦参碱(30mg/kg、90mg/kg)、地塞米松(1mg/kg)干预建模前后,TGF-β1、CTGF、FN mRNA和蛋白表达水平、大鼠阴茎海绵体病理组织学和胶原变化以及勃起功能的改变。结果:氧化苦参碱干预组较模型组TGF-β1、CTGF、FN表达水平明显降低;苦味酸-天狼星红染色显示海绵体内胶原蛋白含量下降;病理组织学检测显示海绵体纤维化程度降低;ICP显示干预组勃起功能有所改善,但低于地塞米松组。结论:氧化苦参碱对hTGF-β1诱导的阴茎海绵体纤维化有预防作用,其可能机制为通过抑制TGF及其下游因子的启动和表达,从而抑制胶原纤维的生成。