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环孢素A（cyclosporin,CsA）作为一种强有力的免疫抑制剂，被广泛地应用于器官移植后抑制免疫排斥反应和自身免疫性疾病的治疗。该药的应用使得器官移植存活率大大提高，肾移植术后一年存活率高达90％。但是，CsA的肾脏毒性大大地限制了它的使用。过去的研究认为，CsA激活肾素血管紧张素系统是其引起慢性肾毒性的根本的病理生理基础。本实验成功地复制了CsA大鼠肾脏慢性损伤模型和CsA致体外培养人肾小管上皮细胞株（HK-2细胞株）损伤模型，观察了反应性氧代谢产物（ROM）的损伤作用、探讨了NF-κB和iNOs在CsA肾毒性中的作用、转化生长因子β1（TGF-β1）的表达和细胞凋亡的发生及线粒体膜电位的改变。旨在加深认识CsA慢性肾毒性的作用机制，为寻找开发高效低毒的免疫抑制药物提供理论依据，同时也为预防和治疗CsA肾损伤提供参考。 Wistar雄性大鼠96只随机分成6个组：分别为溶剂对照组，LNAME组，PDTC组，CsA组，CsA+LNAME组，CsA+PDTC组。给予剂量分别为：CsA 15mg·kg-1·d-1，LNAME 5mg.100ml-1水，PDTC 100mg·kg-1·d-1。CsA溶于橄榄油，浓度为6.25g·L-1过滤除菌，皮下注射。LNAME和PDTC分别溶于蒸馏水，过滤除菌，LNAME自由饮用，PDTC皮下注射。给药4周留尿采血后活杀动物取肾脏组织，行外周血BUN，Cr，和尿NAG酶测定，尿常规检测，肾组织匀浆MDA和GSH-Px测定。并将肾组织制成切片行HE、TUNEL、免疫组化光镜观察，同时制备肾组织超薄切片进行透射电镜观察。 体外培养HK-2细胞株，分成8组：分别为溶剂对照组，LNAME组，PDTC组，LPS组，CsA组，CsA+LNAME组，CsA+PDTC组，CsA+LPS组。CsA加入细胞培养液中使其终浓度分别为0.1，1，10mmol·L-1，LNAME加入细胞培养液中使其终浓度为1mmol·L-1，PDTC加入细胞培养液中使其终浓度为25μmol·L-1。检测线粒体膜电位的变化，细胞凋亡的发生，NF-κB，iNOs，TGF-β1，caspase 3的表达。 实验结果表明，我们成功地复制出了CsA致大鼠肾脏慢性损伤模型。光镜下可以观察到肾皮质肿胀。有的肾小球囊腔消失，球旁小管结构破坏。近曲小管上皮细胞空泡变性，核固缩。改变局部有少量中性粒细胞和巨噬细胞浸润。皮质和髓质交界处见肾小管管腔消失、结构紊乱。电镜下肾血管球内皮细胞基本正常，局部基底膜模糊，足细胞突起低平。系膜细胞突起皱缩，线粒体空化，核缩呈均硕士论文环抱素A致肾脏慢性损伤机理的探讨第4页共58页质状。近曲小管线粒体减少或空化，有的核膜增厚，远曲小管基底褶融合。CsA组和CSA+LNAME组较溶剂对照组、PDTC组、LNAME组和CsA+PDTC组外周血BUN、Cr，尿NAG酶增高，尿常规检查有蛋白尿，尿比重降低;组织匀浆显示MDA增高，GSH一PX下降;TUNEL法可检测到有不同程度的细胞凋亡的发生;免疫组化发现有NF一、B，TGF一日l和easpase3的表达。 在体外培养HK一2细胞株中，CSA组和CSA+LNAME组较溶剂对照组、PDTC组、LNAME组和CSA+PDTC组细胞线粒体膜电位下降;CSA诱导HK一2细胞的凋亡，且与CSA剂量呈现正相关性。加入LNAME阻断N0合成后凋亡细胞明显增加，随着CsA浓度的增加，凋亡细胞增加的同时坏死细胞也随之增加。而加入了PDTC阻断NF一B后，凋亡细胞明显减少，与CsA组相比有显著性差异。肾小管上皮细胞出现NF一KB、TGF一 pl和caspase3的表达;CsA能降低LPS诱导的人肾小管上皮细胞iNOS的表达。 通过以上实验结果可以归纳为:①CSA的慢性肾毒性主要损伤肾小管，可以引起上皮细胞空泡变性，核固缩和结构破坏，肾小球伴有轻度损伤。②反应性氧化代谢产物的增加和肾脏抗氧化能力下降是CSA导致的慢性肾损伤的机制之一。阻断NO的生成加重了氧化应激所致的损伤。而阻断NF一KB的表达能减少反应性氧化代谢产物的产生和肾脏抗氧化能力的提高。③CSA可以导致近曲小管和远曲小管上皮细胞凋亡。阻断N0后并没有阻断CSA所致的凋亡的发生。阻断NF一KB的激活后凋亡发生则明显减少。在CsA慢性肾毒性中，CasPase3表达呈阳性，尸DTC阻断NF一KB后Caspase3的表达减弱，说明NF一KB可能与之相关。④CsA致慢性肾损伤时TGF一pl表达呈阳性。阻断NO使得TGF一旦1的表达增强，而阻断NF一B后未见到TGF一 pl的表达，提示NF一KB可能位于TGF一日1的上游并起调节作用。⑤NO在CsA所致的慢性肾损伤中起保护作用。CSA抑制了肾小管上皮细胞NO的产生，阻断NO的生成后明显加重了CSA的肾毒性。⑥CsA所致的慢性肾损伤中NF一KB被激活，结合阻断NF一B的激活后，各种损伤因素的表现，提示NF一B可能起中心调控作用。