论文部分内容阅读
手性环氧氯丙烷(ECH)是一种高价值的中间体,用以合成药制品和农用化学品,具有广阔的市场前景。手性环氧氯丙烷的合成方法有化学法和生物法,化学法主要使用Salen-Co催化剂,选择性差,成本高,对环境污染严重。生物法选择性较好,且对环境友好。目前全世界的环氧氯丙烷已经出现供大于求的局面,这必将使其价格降低,因此利用廉价的环氧氯丙烷来生产具有社会效益和经济效益的手性化合物将成为研究的热点和前沿。本论文通过生物细胞和固定化酶这两种典型的生物催化剂,来设计催化生产手性环氧氯丙烷的工艺路线,就生物催化剂的表征,制备和应用等方面展开研究。本文首先考察了实验室里筛选到的细菌A.mediolanus ZJB09106的产酶条件,通过单因素试验和正交法优化,获得了该菌株产环氧化物水解酶的较优培养基组分为:柠檬酸钠22.3 g/1,淀粉10.0 g/1,牛肉膏16.0g/l,酵母浸出汁10.0g/l,NaCl5.00g/l。同时也确定最适宜的培养条件为:初始pH 6.5,接种量3%(v/v),装液量100 ml/500 ml。在上述条件下培养32小时后,生物量达到了 4.32 g/1,环氧化物水解酶的酶活力达到了 396.08 U/1。论文还对A.mediolanus ZJB09106的环氧化物水解酶进行了分离纯化和鉴定,通过超声波破碎,硫酸铵沉淀,离子交换层析等步骤,得到该酶的分子量为28 KD左右,纯化倍数为12.4倍,得率为15.2%。通过肽指纹谱图分析,确定该酶和Arthrobactersp.Strain AD2的Haloalcohol Dehalogenase HheA 和Corynebacteri m sp.StrainN-1074的Haloalcohol Dehalogenase HheA具有同源性。通过蛋白质N端的鉴定,确定其前7个氨基酸序列依次为MRIALVT.论文最后用基因工程菌破碎后的粗酶作固定化来手性拆分环氧氯丙烷,考察了固定化酶催化环境对其酶活与选择性的影响。选择了正己烷作为有机相,得到了最佳的固定化酶转化条件:pH7.5,温度30℃,含水量为1.0%。当加入底物浓度为20mM,16小时后,ee值达到100%,得率为10.7%,重复使用7次后,酶活保持在初始酶活的40%左右。经反应条件优化,通过双倒数作图法,求得该反应条件下的反应动力学参数:Vmax=2.331 mmolmin-1g-1,Km=76.28 mmol/l。