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目的:
探讨5％、10％、20％三组不同的氧浓度对大鼠脂肪组织来源的干细胞(ADSCs)向软骨细胞分化程度的影响。
方法:
原代提取Wistar大鼠的腹股沟及睾丸附近的脂肪组织,剪耿附睾脂肪垫,PBS冲洗3-4次,剔除血管和筋膜,消化约50-60min后,滤网滤过,离心10min,接种至50mL培养瓶中,放入正常CO2培养箱中培养,定期换液、传代,观察细胞形态。记录细胞在不同时期的增值数目并绘制成细胞生长曲线,观察细胞不同时期的增值情况。将第3代脂肪干细胞以1×105/mL细胞密度接种于24孔培养板内的无菌盖玻片上,放于CO2培养箱中培养,定期换液,待细胞爬片满80％时,分别向其中2孔内滴加CD29、CD44兔抗大鼠多克隆抗体(1:100)300μL,4℃孵育过夜,后加入二抗,在荧光显微镜下观察细胞表面标志物并照像。脂肪干细胞向软骨方向定向诱导:取第3代生长良好的脂肪干细胞调整细胞密度为1×106/ml分别放入5％、10％、20％三组不同氧浓度的培养箱中培养并定期传代。MTT比色法测定细胞活性:不同培养箱中培养3、7、14天后以1×105/mL细胞密度接种于96孔培养板内,在酶联免疫检测仪上选择490 nm波长比色。免疫组化检测Ⅱ型胶表达:分别取5％、10％低氧培养箱和CO2培养箱中诱导14 d后的细胞爬片,加入一抗、二抗,显微镜观察细胞浆内情况。
结果:
成功的分离Wistar大鼠的腹股沟及睾丸附近脂肪组织,采用不同的培养箱培养并诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化;细胞生长曲线反应细胞生长的速度及生长的平台期;免疫荧光的方法鉴定细胞表面标志CD44、CD29阳性表达;将第三代细胞分别放入5％、10％、20％三种氧浓度的培养箱中培养14天观察三组细胞的Ⅱ型胶原的表达情况,采用spssl8.0对Ⅱ型胶原的灰度值数据进行分析,三组数据间比较均有统计学意义,同时5％氧浓度组最明显;MTT检测5％氧浓度细胞的增殖明显(P＜0.01)。
结论:
本试验研究讨论从Wistar大鼠腹股沟及睾丸的脂肪组织中可提取出脂肪干细胞,在不同的培养条件下诱导分化,最终分化成软骨细胞;5％氧浓度及10％氧浓度组的Ⅱ型胶原的灰度值与20％氧浓度组比较有统计学意义(p＜0.05);MTT法测出5％氧浓度及10％氧浓度组细胞比20％氧浓度组增殖明显,该实验证明了低氧浓度的培养条件能够促进脂肪干细胞增殖分化为软骨细胞。为组织工程提供了重要的种子细胞,同时也为软组织的修复提供了细胞的来源。为软骨修复的组织工程学研究提供新的科学理念。