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目的:研究石英恶性转化永生化人支气管上皮细胞系16HBE中PARP-1基因甲基化变化,运用甲基化抑制剂及RNAi技术沉默PARP-1后,PARP-1甲基化与基因表达之间的关系,探索PARP-1基因甲基化异常在石英致癌过程中的作用。
方法:1.采用16HBE细胞系,MTT试验确定最佳染尘剂量,设300μg/ml石英染尘组和空白对照组,染尘时间24h,隔代染尘共染尘10次。以软琼脂细胞集落形成试验及裸鼠成瘤试验鉴定细胞恶性程度；2.用不同浓度甲基化转移酶抑制剂5Aza-dc处理石英恶性转化细胞(M-16HBE),甲基化特异性PCR(MSP)方法检测PARP-1基因甲基化状态,实时定量PCR检测PARP-1基因mRNA表达水平；3.应用RNAi技术,构建针对PARP-1的siRNA表达载体,脂质体介导的转染方法转染M-16HBE细胞,半定量RT-PCR方法检测mRNA表达水平。
结果:1.细胞培养至35代时,发现石英可诱导16HBE细胞发生恶性转化,M-16HBE细胞在软琼脂中的集落形成率显著高于对照组(P<0.01)；M-16HBE接种裸鼠后能诱发肿瘤形成,病理组织学检查具有恶性肿瘤特征；2.PARP-1基因在M-16HBE细胞中呈异常甲基化状态,在mRNA水平低表达。M-16HBE细胞经5Aza-dc处理后甲基化发生逆转,由完全甲基化转变为不完全甲基化,PARP-1mRNA表达量也随之增高；3.构建PARP-1 siRNA重组质粒并稳定转染M-16HBE细胞,转染组中PARP-1基因表达抑制率明显高于阴性对照组抑制率,有统计学差异(P<0.01)。
结论:1.石英可诱导人支气管上皮细胞16HBE发生恶性转化,构建理想的恶性转化细胞模型；2.石英恶性转化细胞M-16HBE PARP-1启动子区存在CpG岛高甲基化状态,甲基化抑制剂5Aza-dc可逆转PARP-1甲基化状态,启动子区高甲基化是PARP-1基因表达下降的重要因为；3.成功利用RNAi技术抑制PARP-1基因表达,为进一步研究PARP-1基因的功能打下基础。