论文部分内容阅读
荧光相关光谱是一种高灵敏的单分子探测方法,被广泛应用于生命科学及其相关的领域,特别是在核酸杂交检测,基因表达分析,生物分子的相互作用及细胞内的一些生物化学过程的研究中发挥着其它方法无可替代的作用。由于大多数化合物特别是生物分子本身没有荧光(或荧光很弱),用荧光方法(如荧光相关光谱)研究这些化合物时通常需要用荧光染料或荧光量子点进行标记。然而,有机荧光染料的化学稳定性和光稳定性较差,在某些生物应用中受到一定的限制。另外,目前制备的荧光量子点大都由Cd, Pb, Hg, Te, Se等有毒元素组成,不能用于生物体内的检测。金纳米粒子由于其表面效应、体积效应和量子尺寸效应表现出特殊的光学性质,如强的散射特性和吸收特性。另外金纳米粒子生物相容性好、易于与生物分子连接的特性,是一种具有广泛应用前景的生物探针。目前金纳米探针已成功地应用于核酸杂交检测,免疫分析以及细胞成像等领域。现有的检测方法主要有:比色法、紫外光谱法、散射法和动态光散射法,这些方法都有自己的优缺点。主要的缺点在于检测的灵敏度不高,而且都是集合的方法。本论文基于荧光相关光谱基本原理和激光共焦构型,利用金纳米粒子具有非常强的光散射特性,建立了共振散射相关光谱新方法(Resonance Light Scattering Correlation Spectroscopy,RLSCS)。将这一方法成功地应用于金纳米粒子的平动和转动行为的研究,浓度的表征。同时应用于DNA杂交检测和蛋白质的相互作用研究。主要工作包括以下几个方面:1.共振散射相关光谱是基于纳米粒子(如金纳米粒子)的共振散射特性建立的一种单颗粒探测新方法。我们参照荧光相关光谱理论模型,将金纳米粒子共振散射光近似地按照荧光相关光谱中的荧光来处理,建立了散射相关光谱的理论模型,提出了共振散射相关光谱概念。基于激光共焦构型,建立共振散射相关光谱探测系统。对该系统的基本参数进行了系统的研究和优化。显著地减小了系统的检测体积(小于1飞升),提高检测系统的信/背(信号/背景信号)比。该系统能够获得粒径大于15纳米金颗粒的共振散射相关光谱。建立的模型与实验数据很好的吻合。2.基于散射相关光谱建立了一种表征金纳米粒子的平动扩散和转动扩散及其浓度的新方法。我们系统的研究了各种因素对金纳米粒子的平动扩散和转动扩散行为的影响。发现当不同波长激光照射时,仅在激光波长处在共振散射峰位置(纳米金的共振散射波长为600纳米附近)时,金纳米粒子的转动扩散可以被共振散射相关光谱探测。为了证实散射相关光谱曲线中快速运动属于转动扩散,设计了改变针孔孔径的实验,我们发现孔径由35微米增大到110微米时,其平动扩散时间由2.39毫秒相应地增大到3.74毫秒;而转动扩散时间却保持6.06微秒不变,这一实验结果与预测相吻合。基于纳米粒子的平动扩散时间计算了纳米金的动力学半径,其动力学半径与电镜测定结果基本相吻合。从共振散射相关光谱中获得检测体积内的粒子个数,用已知扩散系数的荧光染料测定共振散射相关光谱的检测体积,据此,我们建立了金纳米粒子的浓度测定方法,其测定结果与电镜测定方法基本相吻合。研究结果表明共振散射相关光谱是表征纳米粒子的一种有效的新方法。3.我们将共振光散射相关光谱应用到核酸杂交检测中,建立均相DNA杂交探测新方法。我们首先将两个不同片段的寡核苷酸探针通过巯基引入到纳米金表面,将其与两个片段互补的靶目标DNA加入到体系中,然后用共振光散射相关光谱检测纳米金聚集体的扩散时间和光散射强度来表征纳米金的聚集程度。研究发现随着靶目标DNA的含量不断增加,纳米金聚集体的扩散时间和散射光强度也相应的增加。用单个碱基错配的靶目标DNA加入到体系中,发现其扩散时间和散射光强度也相应的增加,但与完全互补的靶目标DNA相比,其增加的程度要弱一些。该方法检测限达到0.1 nM,与比色法相比,检测限提高了100倍左右。研究结果表明共振光散射相关光谱能够很好的区分DNA碱基序列,同时还可以用于DNA含量的检测,当靶目标DNA的浓度在0-36 nM时,聚集体的扩散时间与核酸浓度有较好的线性关系。与比色法的2-3小时相比,该方法是一种快速检测方法,检测时间也只需要5分钟左右。4.将纳米金共振光散射相关光谱应用于生物分子的相互作用研究。以过氧化酶-生物素与亲和素相互作用为免疫反应模型,通过监测反应体系中纳米金聚集体的扩散时间来确定纳米金与过氧化酶生物素最佳吸附的pH值以及生物素与亲和素反应的最佳pH值。用辣根过氧化酶-生物素通过化学吸附作用修饰到纳米金的表面,加入链霉亲和素(有四个结合位点)结合生物素使得纳米金偶联在一起,通过监测纳米金聚集体的扩散时间测定纳米金的聚集程度。随着链霉亲和素的浓度增加,实验发现金纳米粒子聚集体的扩散时间也相应的延长,当链霉亲和素的浓度达到65 nM时(恰好链霉亲和素与生物素的化学计量比为1︰4),聚集体的扩散时间达到最大值。当链霉亲和素为260 nM和780 nM时,发现聚集体扩散时间反而随着链霉亲和素浓度的增加而减小。当链霉亲和素大大过量时,链霉亲和素迅速地包覆在生物素化的纳米金表面,从而部分抑制了纳米金的交联。通过对纳米金聚集动力学的研究,证实了辣根过氧化酶生物素与亲和素诱导的纳米金聚集过程符合反应限制模型。