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Ataxin-3（ATX3）是包含有Josephin结构域以及泛素结合基序的去泛素化酶，其编码基因ATXN3中CAG重复序列过度扩增引起的ATX3羧基端多聚谷氨酰胺(polyglutamine，polyQ)异常扩增(健康人群:12-40;患者:55-84)可导致脊髓小脑型共济失调3型（SCA3，也称马查多-约瑟夫病/MJD1）。SCA3是一种常染色体显性遗传的神经退行性疾病，为最常见的遗传性共济失调亚型。该疾病患者临床表现为进行性的共济失调、痉挛以及眼球运动障碍。 细胞周期检验点激酶1(Checkpoint kinase1，Chk1)是一种进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在DNA损伤应答中，ATR介导的Chk1磷酸化可激活Chk1，活化的Chk1进而磷酸化其下游靶蛋白以调控细胞内应答损伤的多个生物学过程，如细胞周期停滞、DNA修复、基因转录以及损伤过于严重时的细胞凋亡。 为寻找ATX3蛋白的潜在底物，我们进行了串联纯化及质谱分析。质谱结果显示，除了已知的ATX3相互作用蛋白如VCP、Dynein及Tubulin，Chk1及其E3连接酶复合物组分DDB1/CUL4A、CUL1都存在于ATX3的串联纯化沉淀物中。我们推测具有Josephin结构域及泛素结合基序的去泛素化酶ATX3可能与DDB1/CUL4A、CUL1具有共同的底物，并参与调控Chk1的稳定性。 为探究Chk1是否为ATX3的底物，我们首先检测了ATX3与Chk1是否存在相互作用。我们通过免疫共沉淀实验证实了两者的相互作用，并发现ATX3的Josephin结构域以及全长的Chk1对于两者的相互作用是必需的。进一步实验表明，ATX3与Chk1的相互作用受到DNA损伤的调控，即长期复制压力可导致两者相互作用明显减弱，且参与介导Chk1多泛素化及降解的第345位丝氨酸的磷酸化参与了调控ATX3与Chk1在长期复制压力前后的动态相互作用。 为探究ATX3是否影响Chk1稳定性，我们首先检测了ATX3敲除或敲低是否影响Chk1的蛋白水平。结果表明，ATX3敲除以及敲低均可导致Chk1蛋白水平明显下降，且这种下降并不是由于细胞周期进程或Chk1转录改变引起的。接着，利用蛋白合成抑制剂CHX，我们检测了ATX3敲除及敲低细胞中Chk1的稳定性。实验结果显示，ATX3敲除以及ATX3敲低均可导致Chk1稳定性明显下降。我们利用ATX3敲除细胞构建了稳定表达野生型ATX3以及去泛素化酶活性失活突变体(ATX3-C14A)的稳定细胞系，并对Chk1蛋白稳定性进行了检测。结果表明，ATX3敲除细胞中下降的Chk1稳定性可通过回转野生型ATX3得到恢复，而去泛素化酶失活突变体则不具有这种恢复能力。在具体机制上，我们发现ATX3通过拮抗DDB1/CUL4及FBXO6介导的Chk1多泛素化及降解来促进Chk1的稳定性，并证明了ATX3的去泛素化酶活性对于逆转DDB1/CUL4及FBXO6介导Chk1多泛素化及降解是必需的。 ATX3缺失可导致Chk1蛋白水平及稳定性明显下降，之后我们检测了ATX3缺失导致的Chk1蛋白量下降是否影响其功能。结果表明，ATX3缺失可导致Chk1介导的G2/M期检验点受损、DNA损伤后Chk1磷酸化缺陷、PCNA单泛素化下降以及细胞对复制压力的敏感性增加。ATX3敲除细胞中Chk1磷酸化缺陷以及复制压力敏感性可通过回转野生型ATX3得到完全恢复。因此，ATX3介导的Chk1稳定对于维持Chk1在细胞周期检验点以及DNA损伤修复中的功能是非常重要的。 脊髓小脑共济失调3型（SCA3/MJD1）是由于ATX3蛋白中的多聚谷氨酰胺过度扩增引起。多聚谷氨酰胺异常扩展可能导致ATX3蛋白功能、相互作用因子或定位发生改变，进而产生细胞毒性并导致SCA3疾病发生。我们发现多聚谷氨酰胺扩增并不影响ATX3与Chk1的相互作用，且谷氨酰胺扩增型ATX3仍可拮抗E3连接酶介导的Chk1多泛素化及降解，说明多聚谷氨酰胺异常扩展并未影响ATX3对Chk1的功能调控。 综上所述，我们发现了去泛素化酶ATX3新的底物，即DNA损伤应答过程中的关键激酶Chk1，并证明ATX3通过稳定Chk1进而促进基因组稳定性的维持。