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饲料蛋白质进入机体后,在胃肠道消化酶作用下被降解为肽及游离氨基酸,通过肠道黏膜上皮细胞吸收进入血液,参与机体的代谢过程。日粮氮营养素在机体内的消化与代谢不仅取决于消化道,还涉及肝脏和肌肉等组织器官。在饲料中抗营养物质、活性肽等外源物质干预下,氮营养素的消化与代谢也受到直接或间接的影响。因此,研究外源活性物质对氮代谢的调控作用,可为氮营养素的高效利用,降低氮排放提供重要的理论依据。研究表明,丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Gln)能够提高动物生长性能及小肠对养分的消化吸收,增加机体的氮利用,并能有效地缓解机体的免疫应激,但其作用机理尚不明确。因此,本研究通过在日粮中添加Ala-Gln研究其对正常及应激仔猪氮代谢的影响,并通过对氮代谢网络中关键通路的分析,探讨其可能的调控机制。1.研究日粮添加Ala-Gln及Ala+Gln对仔猪生长性能、血液生化指标及粪中含氮化合物的影响。选取35日龄阉公猪180头(体重约为10kg),随机分为3个处理,每个处理3栏,每栏20头猪,每个处理分别在基础日粮的基础上添加0.62%Ala、0.5%Ala-Gln及0.21%Ala+0.34%Gln,试验期为28天。结果显示:与Ala组相比(对照组),日粮添加Ala-Gln显著增加了仔猪的平均日增重(ADG),降低了料重比(F/G,P<0.05),但对平均日采食量(ADFI,P>0.05)未产生显著影响;日粮添加Ala+Gln对仔猪ADG、ADFI及F/G均无显著影响(P>0.05);日粮添加Ala-Gln显著增加了血液总蛋白(TP,P<0.05)含量,显著降低了血液中乳酸脱氢酶(LDH,P<0.05)水平,对碱性磷酸酶(AKP,P>0.05)的活性并无显著影响;日粮添加Ala+Gln显著增加了血液TP含量(P<0.05),对AKP及LDH含量没有影响(P>0.05);日粮添加Ala-Gln显著降低了粪中铵态氮、色胺、苯乙胺、组胺及酪胺含量(P<0.05),但对粪中腐胺及尸胺含量没有影响(P>0.05);日粮添加Ala+Gln显著降低了色胺及苯乙胺含量(P<0.05),但对铵态氮、组胺、酪胺、腐胺及尸胺含量没有影响(P>0.05)。2.日粮添加Ala-Gln及Ala+Gln对仔猪养分表观消化率、肠道氨基酸及肽传感受体及转运载体表达的影响。试验设计同试验一。结果显示,与Ala组相比,Ala-Gln显著增加了仔猪的粗蛋白表观消化率(P<0.05);日粮添加Ala-Gln显著增加了仔猪空肠胰蛋白酶及胰腺胰蛋白酶活性(P<0.05);日粮添加Ala-Gln显著增加了血浆中亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)、精氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、Gln及脯氨酸的含量(P<0.05),而Ala+Gln显著增加了血浆Leu、Phe、His、Ser及Glu的含量(P<0.05);Ala-Gln显著增加了空肠黏膜氨基酸及肽传感受体表达,如钙离子传感受体(CaSR)、味觉传感受体1及味觉传感受体3异二聚体(T1R1+T1R3)、G蛋白偶联受体93(GPR93)的表达(P<0.05);同时,Ala-Gln也增加了空肠黏膜SLC1A5、SLC6A19、SLC7A7及SLC15A1等转运载体的表达(P<0.05)。3.日粮添加Ala-Gln及Ala+Gln对仔猪肝脏蛋白合成、肌肉蛋白合成及降解的影响。试验设计同试验一。结果显示,与Ala组相比,日粮添加Ala-Gln显著增加了仔猪肝脏及肌肉中Gln及谷氨酸(Glu)的含量(P<0.05);日粮添加Ala-Gln显著增加了肝脏及肌肉中谷草转氨酶(AST)及谷丙转氨酶(ALT)活性(P<0.05),显著降低了肝脏和肌肉中谷氨酰胺合成酶(GS)活性(P<0.05);同时,日粮添加Ala-Gln也显著增加了肝脏及肌肉组织中谷氨酸脱氢酶(GDH)及谷氨酰胺酶(GA)的表达水平(P<0.05)。此外,日粮添加Ala-Gln显著增加了肝脏中氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ(CPS-1)的表达水平(P<0.05)。日粮添加Ala-Gln显著增加了肝脏及肌肉中磷酸化mTOR、磷酸化4E-BP1及磷酸化S6K1的表达水平(P<0.05),显著降低了肌肉中MAFbx及MuRF1的表达水平(P<0.05)。4.日粮添加Ala-Gln对LPS刺激仔猪生长性能、血液生化指标及粪中含氮化合物的影响。在正常仔猪研究结果的基础上,本试验选用Ala-Gln作为外源活性物质。给仔猪腹腔注射LPS,建立仔猪免疫应激模型。采用2×2因子试验设计,即日粮类型(0.62%Ala或0.5%Ala-Gln)和LPS刺激(100μg/kg体重LPS或相同剂量生理盐水),每个处理6栏,每栏4头猪。在头10天,仔猪不进行LPS刺激,分别饲喂含0.62%Ala或0.5%Ala-Gln的日粮,在第11及15天早上8点,仔猪分别被注射LPS或等体积的生理盐水。结果显示,在LPS刺激后(d11-15),LPS刺激显著降低了仔猪的生长性能(P<0.05),Ala-Gln有缓解LPS刺激引起的仔猪平均日增重(P=0.071)及平均日采食量(P=0.087)下降的趋势。LPS刺激显著增加了血液中LDH活性(P<0.05)、降低了血液中AKP活性(P<0.05);LPS显著降低了血液中IGF-1及FT4含量、显著增加了血液中皮质醇含量(P<0.05),而Ala-Gln缓解了LPS引起的皮质醇含量的增加(P<0.05);LPS刺激显著增加了粪中色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺及铵态氮含量(P<0.05),而Ala-Gln添加显著降低了粪中色胺、酪胺及铵态氮含量(P<0.05)。5.Ala-Gln对LPS刺激仔猪养分表观消化率、肠道氨基酸及肽传感受体及转运载体表达的影响。试验设计同试验4。结果显示,LPS刺激显著降低了仔猪干物质(DM)、有机物质(OM)、粗脂肪(EE)及粗蛋白(CP)的表观消化率(P<0.05),而Ala-Gln有增加DM(P=0.095)、OM(P=0.071)及CP(P=0.083)表观消化率的趋势;LPS刺激显著降低了胃蛋白酶活性、空肠胰蛋白酶及胰腺胰蛋白酶活性(P<0.05),而日粮添加Ala-Gln显著增加了胰腺胰蛋白酶活性(P<0.05),并且有显著增加空肠胰蛋白酶活性的趋势(P=0.074);LPS刺激显著降低了血液中Lys、Arg、Tyr、Phe、Leu、Ile等氨基酸的含量(P<0.05),日粮添加Ala-Gln显著增加了Gln、Ile、Leu、Lys及Val等氨基酸的含量(P<0.05);LPS刺激及Ala-Gln均显著增加了CaSR、T1R1、T1R3、GPRC6A及GPR93的表达,并且LPS刺激和日粮添加Ala-Gln对T1R3具有显著的互作效应(P<0.05);LPS刺激显著降低了空肠黏膜SLC1A5、SLC7A9、SLC6A19、SLC7A7、SLC1A1及SLC15A5的表达(P<0.05),Ala-Gln增加了空肠黏膜SLC1A5、SLC7A9、SLC6A19、SLC7A7及SLC15A5的表达水平(P<0.05),但并未显著影响SLC1A1表达(P>0.05)。6.Ala-Gln对LPS应激仔猪肝脏蛋白合成、肌肉蛋白合成及降解的影响。试验设计同试验4。结果显示,LPS刺激增加了血浆中TNF-α、IL-1β、IL-6含量(P<0.05),Ala-Gln显著降低了血浆中上述细胞因子的水平(P<0.05)。LPS刺激显著增加了肝脏中Gin含量,显著抑制了肌肉中Gin含量(P<0.05)。Ala-Gln添加显著增加了肝脏及肌肉中GS活性及GA表达(P<0.05)。LPS刺激显著增加了肝脏C-反应蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白(SAA)及铜蓝蛋白(Cp)的表达(P<0.05),而添加Ala-Gln则降低了CRP、SAA及Cp的表达(P<0.05)。Ala-Gln添加增加了肌肉中IGF-1信号及Akt的表达(P<0.05)。Ala-Gln增加了肝脏及肌肉中磷酸化mTOR、磷酸化4E-BP1及磷酸化S6K1的表达水平。除此之外,Ala-Gin降低了LPS刺激下Toll样受体4、MAFbx及MuRF1的表达(P<0.05),对LPS刺激引起的肌肉蛋白降解具有抑制作用。综上所述,本文得出如下结论:(1)日粮添加0.5%Ala-Gln显著提高了正常仔猪生长性能,降低了粪中含氮化合物排放,提高了仔猪日粮氮表观消化率、空肠黏膜氨基酸及肽传感受体及转运载体的表达,对养分的消化吸收具有促进作用,并且日粮添加Ala-Gln二肽的效果要优于Ala+Gln联合添加组。(2)日粮添加Ala-Gln可显著增加了肝脏及肌肉中GA及GDH表达,提高了Gln利用及肝脏和肌肉mTOR信号分子表达,并且显著抑制了肌肉MAFbx及MuRF1表达,有利于增加肝脏及肌肉蛋白合成,抑制肌肉蛋白降解。而Gln对蛋白合成增加和蛋白降解抑制的作用可能与肝脏和肌肉中Gin的代谢增加有关。(3)LPS刺激显著降低了仔猪生长性能和养分表观消化率,同时抑制了空肠黏膜氨基酸及肽转运载体的表达,抑制了仔猪养分消化利用。日粮添加Ala-Gln增加了空肠黏膜氨基酸及肽传感受体及转运载体的表达,有增加仔猪养分表观消化率的趋势,在一定程度上能够缓解LPS应激对仔猪养分消化吸收的抑制作用。(4)LPS刺激显著增加了肝脏中Gln含量,显著增加了肝脏中急性期蛋白表达及mTOR蛋白信号,而日粮添加Ala-Gln则降低了肝脏中急性期蛋白表达,对LPS引起的肝脏应激具有缓解作用。LPS刺激显著降低了肌肉中Gln含量及肌肉中mTOR信号,提高了 MAFbx及MuRF1的表达从而诱导了肌肉蛋白的降解。日粮添加Ala-Gln增加了肌肉中Gln含量,增加了肌肉mTOR信号分子的表达,并且通过抑制UPP及TLR4通路中信号分子的表达而有效地抑制了LPS刺激引起的仔猪肌肉蛋白降解。