小反刍兽疫病毒N75-1株入侵宿主细胞的途径研究

• 作 者: 陈志杰
• 机 构: 西北农林科技大学
• 出 处: 西北农林科技大学
• 发表日期: 2017年期
• 关键词: 小反刍兽疫病毒 山羊子宫内膜上皮细胞 入侵 内吞途径

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的感染小反刍兽的一类动物传染病。近年来,PPRV的研究大多集中在蛋白功能以及疫苗制备等方面,有关PPRV入侵宿主细胞的途径研究少有报道。本试验目的在于探究PPRV对山羊子宫内膜上皮细胞(Goat endometrial epithelial cells,EEC)的感染特性,以及病毒进入宿主细胞的内吞途径,从而为研究该病毒对宿主细胞的感染机制提供相关的理论基础及科学依据。研究结果如下:1.获得了PPRV在山羊子宫内膜上皮细胞上的增殖规律。PPRV接种于EEC细胞后24 h到48 h后细胞无明显的形态学变化,72h发现细胞发生典型的细胞病变(cytopathic effect,CPE),细胞聚集在一起,形成合胞体,折光性变强等,96 h后细胞出现裂解、死亡现象。EEC接种PPRV N75-1株后,激光共聚焦观察确定该病毒进入细胞的时间在1-2 h内。收取1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h的细胞上清,TCID50检测发现病毒滴度在感染后24 h达到最高;收取0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h的细胞样品,Western Blot检测表明N蛋白的表达在感染后12 h表达量最大,24h有所下降,获得了PPRV在EEC细胞上的增殖规律。2.PPRV入侵EEC不通过网格蛋白介导的内吞途径。用内吞途径的网格蛋白抑制剂氯丙嗪(CPZ)处理EEC,接毒后激光共聚焦显微镜观察进入细胞的PPRV与对照组相比无明显差异;Western Blot以及TCID50检测发现N蛋白的表达和毒价亦无明显变化。将网格蛋白的的siRNA转染EEC中,接毒后Western Blot以及TCID50检测N蛋白的表达以及PPRV毒价亦无明显变化。实验结果表明,PPRV入侵EEC不通过网格蛋白介导的内吞途径。3.PPRV入侵EEC是通过Caveola介导的內吞途径。用膜穴样凹陷内吞途径抑制剂甲基-β-环糊精(MβCD)和制霉素(Nystatin)两种药物处理EEC,接种PPRV后激光共聚焦显微镜观察到进入细胞的病毒相对于对照组明显减少。Western Blot检测发现,药物处理组PPRV-N蛋白表达与对照相比均显著减少。将Caveolin-1的siRNA转染EEC后接种PPRV,Western Blot以及TCID50检测发现N蛋白表达和病毒滴度明显降低。实验结果表明,PPRV入侵EEC是通过Caveola介导的內吞途径。综上所述,本研究通过特异性化学抑制剂阻断、siRNA干扰方法确定,PPRV入侵EEC是依赖膜穴样凹陷介导的内吞途径。研究结果为了解PPRV的致病机制和寻找新的药物治疗靶点提供理论依据。