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随着干细胞研究领域的飞速发展和实验技术的进步,“肿瘤干细胞学说”再次受到人们的关注。目前已陆续在白血病、乳腺癌、脑肿瘤、结肠癌、肝癌和前列腺癌中得到证实,并被越来越多的学者所接受,并认为,是肿瘤发生起源、演进、转移和复发的根源。由于肿瘤干细胞在肿瘤细胞中所占比例很低,且培养条件苛刻,如何建立稳定的肿瘤干细胞分离培养平台是该研究领域必须解决的关键问题。肿瘤干细胞相继在多形性胶质母细胞瘤等神经上皮源性肿瘤中得到证实,多篇报道胶质瘤干细胞(glioma stem cell, GSCs)的存在[1-6]。在中枢神经系统肿瘤中,少突胶质细胞源性肿瘤的发病率仅次于星形细胞肿瘤[7]。间变性少突-星形细胞瘤具有明显的生长侵袭性,对人体危害很大。目前尚缺乏少突-星形细胞瘤中GSCs的研究报道。胚胎干细胞和成体干细胞的分化主要受控于其表观遗传学机制,基因组甲基化是表观遗传学机制的重要组成部分[8]。肿瘤干细胞表观遗传学机制,特别DNA甲基化状态尚未见报道。阐明肿瘤干细胞表观遗传学机制在肿瘤诱导分化治疗中具有重要意义。本研究运用组织块干涸培养法培养人间变性少突-星形细胞瘤肿瘤细胞,在此基础上利用条件培养基压力筛选和单克隆培养法从肿瘤细胞中分离培养出GSCs,并运用免疫荧光染色和克隆形成对其进行了鉴定。此外,利用皮下注射GSCs进行体内肿瘤实验。此外,利用RT-PCR检测了人恶性胶质瘤细胞系U87中GSCs和贴壁肿瘤细胞中DNMT1的mRNA水平,分别采用Western blot和免疫荧光染色检测了DNMT1蛋白表达水平,运用高效液相色谱检测了GSCs和贴壁肿瘤细胞的基因组甲基化水平。主要结果和结论如下:1.人间变性少突-星形细胞瘤中表达干细胞标志物的肿瘤细胞和GSCs的分离培养(1)免疫荧光染色显示,肿瘤组织中散在分布着共表达神经干细胞标志物CD133和Nestin的肿瘤细胞。(2)运用组织块干涸培养法从人间变性少突星形细胞瘤中培养出原代肿瘤细胞,这一步相对简单,容易操作。获得了一些干涸培养的体会,包括在放入组织块之前要用胎牛血清预润培养瓶底,培养瓶中细胞块的大小应在1mm3以下,铺展的间距应大于5mm,倒置时间应该在3至4小时之间。(3)利用条件培养基压力筛选和单克隆培养法从肿瘤细胞中分离培养出具有干细胞特性的肿瘤细胞,即GSCs。在干细胞完全培养基中,分化的肿瘤细胞贴壁并且生长受到抑制,而GSCs能够在培养基中呈克隆球样悬浮生长。传代后,适当比例接种培养,单细胞可逐渐形成较多的细胞球,形态同前一代细胞球相似。2.GSCs的鉴定免疫荧光染色显示干细胞完全培养基中悬浮生长的克隆球表达神经干细胞标志物CD133和Nestin。将其重新接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基后,克隆球可以贴壁分化,免疫荧光染色显示分化的细胞部分表达GFAP,部分表达MBP,两种均为少突-星形细胞肿瘤中的分化标志物,具有多向分化能力。双标染色显示,大部分分化细胞在分化标志物的表达上没有重叠,少部分分化细胞有GFAP和MBP的共表达。有限稀释法结果显示,原代肿瘤细胞中,具有自我更新能力并且能够呈克隆球样生长的细胞比例约为2.49%±0.13%,而克隆球中有36.54%±1.41%的细胞具有自我更新能力,能够进行对称分裂,使干细胞在条件培养基中增殖。3.人间变性少突-星形细胞瘤GSCs体内研究模型的建立(1)与贴壁分化的肿瘤细胞相比,GSCs具有更强的致瘤能力。接种10周后,接种干细胞完全培养基中的贴壁细胞的SCID小鼠皮下均未见移植瘤长出,而接种GSCs的SCID小鼠右腋下均见移植瘤长出,5 x 103细胞量接种组移植瘤体积为0.38±0.08 cm3,5 x 104细胞量接种组移植瘤体积为0.64±0.02 cm3,两组间存在显著性差异。(2)人少突-星形细胞瘤中干细胞样的肿瘤细胞可以在小鼠体内重建原发瘤的分化表型。结果显示,移植瘤中可以检测到CD133以及Nestin阳性细胞呈巢状分布,与患者原发瘤相比,移植瘤中具有干细胞样表型的肿瘤细胞比例明显升高。移植瘤组织中还有散在分布着GFAP阳性细胞和MBP阳性细胞。4.利用RT-PCR检测了人恶性胶质瘤细胞系U87中胶质瘤干细胞和贴壁肿瘤细胞中DNMT1的mRNA水平,利用Western blot和免疫荧光染色检测了DNMT1蛋白表达水平,运用高效液相色谱检测了人恶性胶质瘤细胞系U87中胶质瘤干细胞和贴壁肿瘤细胞的全基因组甲基化水平。与贴壁肿瘤细胞相比,肿瘤干细胞DNMT1的mRNA水平没有差别,但DNMT1蛋白表达明显升高。人恶性胶质瘤细胞系U87中胶质瘤干细胞和贴壁肿瘤细胞全基因组甲基化水平没有差别。综上所述,人间变性少突-星形细胞瘤组织中存在胶质瘤干细胞。这些细胞在肿瘤组织中所占比例很低,表达神经干细胞标志物CD133和Nestin,在干细胞完全培养基中呈克隆球样悬浮生长,具有自我更新和多向分化能力,与贴壁分化的肿瘤细胞相比,有更强的成瘤能力。人恶性胶质瘤细胞系U87中GSCs和贴壁肿瘤细胞全基因组甲基化水平未见明显差别,但DNMT1的蛋白表达明显上调。结果提示,抑制DNMT1的表达水平或活性可能促进GSCs的分化,并成为新的治疗靶点。