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目的:成肌细胞是起源于肌肉卫星细胞的肌源细胞,具有分化、增殖等能力,成肌细胞衰老与骨骼肌减少相关疾病的发病密切相关。自噬作为细胞生存的一种应激反应,在细胞自稳中发挥重要的作用,有研究表明随着衰老发生,自噬活性逐渐被抑制。而自噬对成肌细胞衰老的调控作用及调控机制尚不十分明确。本研究使用D-半乳糖诱导C2C12细胞模拟骨骼肌成肌细胞衰老,以研究自噬与衰老成肌细胞的作用关系及机制,为骨骼肌减少相关疾病的诊疗提供新的参考。方法:1.D-半乳糖干预C2C12成肌细胞后,通过β-半乳糖苷酶染色、Western-blot、JC-1线粒体膜电位、超氧化物歧化酶实验对β-半乳糖苷酶的活性、P53和P16蛋白表达水平、线粒体功能和细胞抗氧化应激活性等衰老相关指标进行检测。2.D-半乳糖干预C2C12成肌细胞后,通过western-blot分析P62、LC3蛋白表达,免疫荧光检测P62的变化,观察自噬水平改变。3.实验分为四组:对照组(MOCK组)、D-半乳糖组(D-GAL组)、雷帕霉素预处理的D-半乳糖组(D-GAL+RAPA组)、3-甲基腺嘌呤预处理的D-半乳糖组(DGAL+3-MA组)。β-半乳糖苷酶染色、线粒体膜电位JC-1、超氧化物歧化酶和Westernblot实验检测C2C12成肌细胞衰老水平变化。EdU-488和流式细胞术分析细胞增殖水平与周期分布改变。4.实验分为四组:对照组(MOCK组)、D-半乳糖组(D-GAL组)、雷帕霉素预处理的D-半乳糖组(D-GAL+RAPA组)、3-甲基腺嘌呤预处理的D-半乳糖组(DGAL+3-MA组)。用Western-blot检测Hippo信号通路相关蛋白(Mst1/2、p-LATs1/2、YAP、p-YAP1)的表达变化。结果:1.D-半乳糖诱导C2C12成肌细胞衰老:D-半乳糖干预后,C2C12细胞表达β-半乳糖苷酶、P53和P16增加;超氧化物歧化酶活性被抑制;线粒体膜电位染色多呈绿色荧光,线粒体损伤增加。2.D-半乳糖抑制自噬活性:免疫印迹结果显示从D-半乳糖干预后9小时起,微管相关蛋白1轻链3由Ⅰ型向Ⅱ型转化减少,自噬相关蛋白P62增多;P62免疫荧光观察到颗粒状荧光在胞浆聚集。3.自噬抑制D-半乳糖诱导的C2C12成肌细胞衰老:与D-半乳糖干预组相比,雷帕霉素预处理细胞后,衰老相关的半乳糖苷酶、P53和P16蛋白减少,超氧化物歧化酶活性增强,线粒体膜电位红色荧光增多。4.自噬抑制D-半乳糖对C2C12成肌细胞增殖、周期的影响:与D-半乳糖干预组相比,雷帕霉素预处理细胞后,EdU阳性的增殖细胞增多,处于G0/G1期细胞减少。5.自噬通过抑制Hippo信号通路抑制C2C12成肌细胞衰老:免疫印迹结果显示D-半乳糖促进Hippo信号通路相关蛋白LATS1/2、YAP1磷酸化,雷帕霉素预处理后,磷酸化的LATS1/2、YAP1蛋白减低。结论:D-半乳糖诱导C2C12成肌细胞衰老,抑制成肌细胞自噬活性和增殖能力,诱导细胞周期阻滞。增强自噬水平可以通过抑制Hippo信号通路抑制C2C12成肌细胞衰老。这些结果为研究肌源细胞衰老的发生发展提供理论基础,为骨骼肌减少相关疾病的防治提供新的思路。