论文部分内容阅读
目的：本研究使用大鼠肝纤维化造模技术及大鼠肝窦内皮细胞(Hepatic sinusoidal endothelial cells，HSECs)分离培养技术，构造体外大鼠HSECs纤维化损伤模型，以黄芪多糖(Astragalus polysaccharides，APs)作为研究药物对其进行干预，通过观察药物干预后，对大鼠HSECs纤维化损伤模型表面窗孔数目、窗孔直径、窗孔总面积及细胞铺展情况的影响，来探究APs抗肝纤维化可能的生物药理学机制。
方法：选用无特定病原体(Specific pathogen Free,SPF )级别的体重160-180g纯系Wistar雄性大鼠40只，随机分为实验组和对照组，按逐步增高四氯化碳和乙醇浓度的方法建立大鼠肝纤维化模型，第一周至第二周以0.3ml/100g的量腹腔注射40%的CCL4橄榄油混合溶液，2次/周，以5%乙醇溶液作为饮用水，SPF繁殖料喂养；第三到四周以50%的CCL4橄榄油混合溶液按0.3ml/100g腹腔注射，2次/周，以10%酒精溶液作为饮用水，SPF繁殖料喂养；第5-8周以60%四氯化碳橄榄油混合溶液按0.3ml/100g腹腔注射，2次/周，以20%乙醇溶液作为饮用水，SPF繁殖料喂养。将造模成功的肝纤维化大鼠在无菌条件下由颈静脉采血取血清，置于-80℃冰箱保存备用。取SPF级体重270g左右雄性Wistar大鼠，采用在体Ⅳ型胶原酶灌注、离体DNA酶I消化、Percoll细胞分离液梯度离心法，提取大鼠肝窦内皮细胞，置于底部放有玻片的24孔培养板中，分别标记为空白对照组与实验组，用内皮细胞专用培养液培养，将24孔培养板放入含5%CO2的37℃孵箱中培养。待24h细胞贴壁后，将10%肝纤维化大鼠血清作为损伤因素加入实验组贴壁的细胞中继续培养24h，诱导实验组HSECs损伤，建立肝纤维化大鼠HSECs损伤模型。在实验组中随机选取三孔细胞以培养液培养为模型对照组，将高(200μg/ml)中(100μg/ml)低(50μg/ml)浓度的黄芪多糖溶液，分别作用于实验组的HSECs，每组三孔细胞，放入37℃恒温，5%CO2孵箱中培养24h。将经APs干预24h后的HSECs玻片及空白组与模型对照组HSECs玻片取出，用PBS缓冲液浸洗三遍，加入2.5%戊二醛固定液固定2h，用乙醇梯度脱水法将HSECs玻片样品脱水，完成脱水的样品用二氧化碳临界点干燥仪进行干燥。二氧化碳临界点干燥完成后，利用环境扫描电子显微镜在低真空状态下对样品进行观察，每组选取10个完整的细胞，每个细胞拍摄1张照片，用ImageJ软件分别测量细胞的铺展面积，细胞上选取直径超过100nm的窗孔进行描记并用ImageJ软件计算窗孔数目及相应面积，所有数据分类登记入Excel表里。实验数据用SPSS22.0软件包以进行统计学分析，计量资料用均数±标准差(-x±s)表示，然后进行统计分析，从而观察不同浓度APs对纤维化损伤的HSECs窗孔的影响。
结果：1.大鼠肝脏切片HE染色显示在中央静脉区及汇管周围有胶原纤维形成，可见炎性细胞浸润，无假小叶形成。2.percoll离心后可见明显分层，肝窦内皮细胞浑浊带明显，每只健康雄性大鼠分离肝窦内皮细胞数约为(2-3)x107。3.用CD31免疫荧光鉴定HSECs呈现红色荧光，细胞核呈现蓝色荧光；电镜下可见肝窦内皮细胞表面特殊窗孔结构。4.空白组大鼠HSECs细胞铺展面积为4.47E8±0.72E8(nm2)，纤维化模型组细胞铺展面积为2.82E8±0.55E8(nm2)，模型组细胞铺展面积明显小于空白组，差异具有统计学意义(P＜0.01)；空白组大鼠HSECs单孔面积为2.50E5±0.79E5(nm2)，纤维化模型组HSECs单孔面积为2.00E5±0.88E5(nm2)，空白组HSECs单孔面积大于模型组，差异具有统计学意义(P＜0.01)。5.纤维化模型组细胞铺展面积为2.82E8±0.55E8(nm2)，APs低浓度干预组细胞铺展面积为3.59E8±1.58E8(nm2)，APs中浓度干预组细胞铺展面积为4.39E8±0.72E8(nm2)，APs高浓度干预组细胞铺展面积为3.69E8±1.04E8(nm2)，其中APs中浓度干预组与纤维化模型组差异具有统计学意义(P＜0.01)，即黄芪多糖干预组细胞铺展面积大于纤维化损伤模型组细胞铺展面积。6.纤维化模型组HSECs窗孔总面积为9.31E7(nm2)，APs低浓度干预组HSECs窗孔总面积为1.14E8(nm2)，APs中浓度干预组HSECs窗孔总面积为1.47E8(nm2)，APs高浓度干预组HSECs窗孔总面积为1.37E8(nm2)；APs干预组HSECs窗孔总面积大于纤维化损伤模型组。7.纤维化模型组HSECs单孔面积为2.00E5±0.88E5(nm2)，APs低浓度干预组HSECs单孔面积为2.27E5±0.81E5(nm2)，APs中浓度干预组HSECs单孔面积为2.38E5±0.90E5(nm2)，APs高浓度干预组HSECs单孔面积为2.41E5±0.90E5(nm2)，APs干预组HSECs单孔面积大于纤维化模型组，差异具有统计学意义(P＜0.01)。8.纤维化模型组HSECs窗孔总数为466，APs低浓度干预组HSECs窗孔总数为502，APs中浓度干预组HSECs窗孔总数为616，APs高浓度干预组HSECs窗孔总数为568，APs干预组HSECs窗孔数量大于纤维化损伤模型组。
结论：从大鼠肝纤维化模型肝组织切片结果来看，本研究成功建立了大鼠肝纤维化模型。从percoll密度梯度离心分层结果及肝窦内皮细胞图像看，本研究成功提取出了大鼠肝窦内皮细胞。通过CD31免疫荧光鉴定，成功识别出HSECs，肝窦内皮细胞表面特殊的窗孔结构亦鉴定出原代HSECs。从空白组大鼠HSECs细胞铺展面积与纤维化模型组细胞铺展面积对比结果、空白组大鼠HSECs单孔面积与纤维化损伤HSECs单孔面积对比结果中可见，本研究较成功的建立了体外肝窦内皮细胞纤维化损伤模型。从HSECs窗孔总面积结果与HSECs窗孔总数目结果，可见黄芪多糖对体外培养的纤维化损伤后的肝窦内皮细胞窗孔数目及窗孔总面积有一定的干预作用，这个改变可能会有效减缓HSECs毛细血管化的发生及进展。从HSECs细胞铺展面积结果看出，APs对体外培养状态下的纤维化损伤型HSECs贴壁铺展具有一定的积极作用。从HSECs单孔面积结果来看，HSECs毛细血管化的逆转可能是通过改善肝血窦内的物质代谢与能量交换，从而对肝纤维化的防治起到了积极的作用。
方法：选用无特定病原体(Specific pathogen Free,SPF )级别的体重160-180g纯系Wistar雄性大鼠40只，随机分为实验组和对照组，按逐步增高四氯化碳和乙醇浓度的方法建立大鼠肝纤维化模型，第一周至第二周以0.3ml/100g的量腹腔注射40%的CCL4橄榄油混合溶液，2次/周，以5%乙醇溶液作为饮用水，SPF繁殖料喂养；第三到四周以50%的CCL4橄榄油混合溶液按0.3ml/100g腹腔注射，2次/周，以10%酒精溶液作为饮用水，SPF繁殖料喂养；第5-8周以60%四氯化碳橄榄油混合溶液按0.3ml/100g腹腔注射，2次/周，以20%乙醇溶液作为饮用水，SPF繁殖料喂养。将造模成功的肝纤维化大鼠在无菌条件下由颈静脉采血取血清，置于-80℃冰箱保存备用。取SPF级体重270g左右雄性Wistar大鼠，采用在体Ⅳ型胶原酶灌注、离体DNA酶I消化、Percoll细胞分离液梯度离心法，提取大鼠肝窦内皮细胞，置于底部放有玻片的24孔培养板中，分别标记为空白对照组与实验组，用内皮细胞专用培养液培养，将24孔培养板放入含5%CO2的37℃孵箱中培养。待24h细胞贴壁后，将10%肝纤维化大鼠血清作为损伤因素加入实验组贴壁的细胞中继续培养24h，诱导实验组HSECs损伤，建立肝纤维化大鼠HSECs损伤模型。在实验组中随机选取三孔细胞以培养液培养为模型对照组，将高(200μg/ml)中(100μg/ml)低(50μg/ml)浓度的黄芪多糖溶液，分别作用于实验组的HSECs，每组三孔细胞，放入37℃恒温，5%CO2孵箱中培养24h。将经APs干预24h后的HSECs玻片及空白组与模型对照组HSECs玻片取出，用PBS缓冲液浸洗三遍，加入2.5%戊二醛固定液固定2h，用乙醇梯度脱水法将HSECs玻片样品脱水，完成脱水的样品用二氧化碳临界点干燥仪进行干燥。二氧化碳临界点干燥完成后，利用环境扫描电子显微镜在低真空状态下对样品进行观察，每组选取10个完整的细胞，每个细胞拍摄1张照片，用ImageJ软件分别测量细胞的铺展面积，细胞上选取直径超过100nm的窗孔进行描记并用ImageJ软件计算窗孔数目及相应面积，所有数据分类登记入Excel表里。实验数据用SPSS22.0软件包以进行统计学分析，计量资料用均数±标准差(-x±s)表示，然后进行统计分析，从而观察不同浓度APs对纤维化损伤的HSECs窗孔的影响。
结果：1.大鼠肝脏切片HE染色显示在中央静脉区及汇管周围有胶原纤维形成，可见炎性细胞浸润，无假小叶形成。2.percoll离心后可见明显分层，肝窦内皮细胞浑浊带明显，每只健康雄性大鼠分离肝窦内皮细胞数约为(2-3)x107。3.用CD31免疫荧光鉴定HSECs呈现红色荧光，细胞核呈现蓝色荧光；电镜下可见肝窦内皮细胞表面特殊窗孔结构。4.空白组大鼠HSECs细胞铺展面积为4.47E8±0.72E8(nm2)，纤维化模型组细胞铺展面积为2.82E8±0.55E8(nm2)，模型组细胞铺展面积明显小于空白组，差异具有统计学意义(P＜0.01)；空白组大鼠HSECs单孔面积为2.50E5±0.79E5(nm2)，纤维化模型组HSECs单孔面积为2.00E5±0.88E5(nm2)，空白组HSECs单孔面积大于模型组，差异具有统计学意义(P＜0.01)。5.纤维化模型组细胞铺展面积为2.82E8±0.55E8(nm2)，APs低浓度干预组细胞铺展面积为3.59E8±1.58E8(nm2)，APs中浓度干预组细胞铺展面积为4.39E8±0.72E8(nm2)，APs高浓度干预组细胞铺展面积为3.69E8±1.04E8(nm2)，其中APs中浓度干预组与纤维化模型组差异具有统计学意义(P＜0.01)，即黄芪多糖干预组细胞铺展面积大于纤维化损伤模型组细胞铺展面积。6.纤维化模型组HSECs窗孔总面积为9.31E7(nm2)，APs低浓度干预组HSECs窗孔总面积为1.14E8(nm2)，APs中浓度干预组HSECs窗孔总面积为1.47E8(nm2)，APs高浓度干预组HSECs窗孔总面积为1.37E8(nm2)；APs干预组HSECs窗孔总面积大于纤维化损伤模型组。7.纤维化模型组HSECs单孔面积为2.00E5±0.88E5(nm2)，APs低浓度干预组HSECs单孔面积为2.27E5±0.81E5(nm2)，APs中浓度干预组HSECs单孔面积为2.38E5±0.90E5(nm2)，APs高浓度干预组HSECs单孔面积为2.41E5±0.90E5(nm2)，APs干预组HSECs单孔面积大于纤维化模型组，差异具有统计学意义(P＜0.01)。8.纤维化模型组HSECs窗孔总数为466，APs低浓度干预组HSECs窗孔总数为502，APs中浓度干预组HSECs窗孔总数为616，APs高浓度干预组HSECs窗孔总数为568，APs干预组HSECs窗孔数量大于纤维化损伤模型组。
结论：从大鼠肝纤维化模型肝组织切片结果来看，本研究成功建立了大鼠肝纤维化模型。从percoll密度梯度离心分层结果及肝窦内皮细胞图像看，本研究成功提取出了大鼠肝窦内皮细胞。通过CD31免疫荧光鉴定，成功识别出HSECs，肝窦内皮细胞表面特殊的窗孔结构亦鉴定出原代HSECs。从空白组大鼠HSECs细胞铺展面积与纤维化模型组细胞铺展面积对比结果、空白组大鼠HSECs单孔面积与纤维化损伤HSECs单孔面积对比结果中可见，本研究较成功的建立了体外肝窦内皮细胞纤维化损伤模型。从HSECs窗孔总面积结果与HSECs窗孔总数目结果，可见黄芪多糖对体外培养的纤维化损伤后的肝窦内皮细胞窗孔数目及窗孔总面积有一定的干预作用，这个改变可能会有效减缓HSECs毛细血管化的发生及进展。从HSECs细胞铺展面积结果看出，APs对体外培养状态下的纤维化损伤型HSECs贴壁铺展具有一定的积极作用。从HSECs单孔面积结果来看，HSECs毛细血管化的逆转可能是通过改善肝血窦内的物质代谢与能量交换，从而对肝纤维化的防治起到了积极的作用。