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乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)是动物神经系统中最重要的酶系之一,根据其活性能够被有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂强烈抑制的原理,可利用AChE检测农产品和环境中这两类农药的残留量。不同生物的AChE的敏感性不同,从动物组织中提取的AChE粗酶液除了含有AChE外,还有脂类和其他多种酶类存在,会显著影响到酶检测农药残留的灵敏度和可靠性。因此,需要对酶源进行筛选和纯化。
本论文采用鲫鱼、麦穗鱼、罗非鱼、桂花鱼、太阳鱼、鲈鱼等6种鱼脑AChE为研究材料。研究比较6种鱼脑AChE的基础比活力。结果表明,AChE基础比活力由高到低依次为:麦穗鱼、鲫鱼、罗非鱼、桂花鱼、鲈鱼、太阳鱼。麦穗鱼脑AChE的基础比活力最高,为0.669μmol·min-1·mg-1,太阳鱼AChE的基础比活力最低,为0.227μmol·min-1·mg-1。以有机磷农药甲胺磷和氨基甲酸酯农药克百威作为酶的抑制剂,通过测定抑制剂对各酶源的AChE的抑制中浓度(IC50)和双分子速率常数(Ki),比较酶源的敏感性。甲胺磷对6种酶源IC50由小到大依次为:罗非鱼、桂花鱼、麦穗鱼、鲫鱼、鲈鱼、太阳鱼;Ki值由大到小依次为:罗非鱼、麦穗鱼、鲫鱼、桂花鱼、鲈鱼、太阳鱼。克百威对6种酶源IC50由小到大依次为:鲫鱼、麦穗鱼、桂花鱼、罗非鱼、鲈鱼、太阳鱼,Ki值由大到小依次为:鲫鱼、桂花鱼、麦穗鱼、罗非鱼、鲈鱼、太阳鱼。由上可知,通过IC50和Ki值评判酶源对抑制剂的敏感性,测定结果是基本一致的。抑制剂对各酶源AChE的抑制作用与农药浓度呈线性相关,其相关系数均在0.9以上。比较6种鱼脑AChE对底物碘化硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholineiodide,ATCH)的亲和力和反应速度,罗非鱼和鲫鱼AChE对底物ATCH亲和力比较大,太阳鱼和鲫鱼AChE对底物ATCH的反应速度较快。通过综合比较,鲫鱼AChE对甲胺磷和克百威这两种农药的敏感性都比较好,对底物的亲和力比较高,因此选用鲫鱼作为纯化的研究对象。
采用硫酸铵沉淀-普鲁卡因胺亲和层析技术对鲫鱼鱼脑AChE分离纯化,纯化倍数为206.62倍。纯化酶经过SDS-PAGE检验呈一条带,表明其纯度达电泳纯,其相对分子量约为41.2 KD。对纯酶质谱分析,进一步确定单一条带为AChE,得到鲫鱼鱼脑AChE的氨基酸序列,为下一步的基因克降和大量表达高灵敏度的AChE提供了基础。
研究纯化前后鲫鱼鱼脑AChE对甲胺磷和克百威的敏感性、最适反应pH、最适反应温度、最适底物浓度和稳定性。结果显示,纯AChE对甲胺磷和克百威的敏感性比粗酶液有明显的提高,甲胺磷对鲫鱼AChE的抑制,纯AChE比粗AChE的IC50提高了2.7倍。克百威对鲫鱼AChE的抑制,纯AChE比粗AChE的IC50提高了2.2倍,pH值、温度对粗AChE和纯AChE活性影响的差异不显著。而底物浓度对粗AChE和纯AChE活性影响差异显著,当底物浓度为1.72mmol·L-1时,粗酶液活性达到最大;当底物浓度为1.39mmol·L-1时,纯AChE的活性达到最大,原因可能是纯AChE在反应中更易形成多个底物与酶的复合物,对底物抑制作用更敏感。-20℃条件下贮存下保存6个月,纯酶活性下降34.54％,而粗酶液下降83.59%,因此,应用纯酶测定农产品和环境中的农药残留更具有实际意义。