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胃癌的发病机制还不清楚。近年来，随着对肿瘤干细胞(Cancer stem cells，CSCs)研究的不断深入，在胃癌研究领域，亦加深了对胃癌起源与发病机制的认识。人们发现胃癌也是一种干细胞疾病，胃癌可能起源于胃腺峡部的原始干细胞。作为长寿命的细胞，胃干细胞成为基因突变和积累的靶细胞，可能在胃癌的最早期阶段发挥重要作用。
目前，由于缺乏特异性标志物，阻碍了对胃癌干细胞(gastric cancer stem cells，GCSCs)的识别和分离，而分离出胃癌干细胞才能进一步研究其功能及作用机制。我国胃癌的早期诊断率仅为10％-15％，因此发现新的能够预警胃癌的生物标志物至关重要。识别胃癌干细胞，将为胃癌的预警和早期诊断提供客观、有力的依据。为此，本课题就胃癌干细胞的识别、鉴定及其在胃癌早期诊断中的作用等问题做了初步研究。
目的:
1、以肿瘤细胞系为模型，分析潜在的肿瘤干细胞标志物在胃癌细胞中的表达;
2、分析CD44分子作为胃癌细胞系中胃癌干细胞表面标志物的可行性，建立胃癌干细胞的分选、富集方法，并进行胃癌干细胞的鉴定和功能研究，为下一步研究奠定基础;
3、分析CD44和OVA66在胃癌组织、癌旁组织和正常胃粘膜中的表达差异，建立胃癌预警和早期诊断的生物标志物;
4、以肿瘤细胞系为模型，分析胃干/祖细胞标志物在胃癌细胞系中的表达，探讨胃癌干细胞与胃干/祖细胞的关系。
方法:
1、胃癌干细胞表面标志物表达的研究:选取4株人胃癌细胞系，用流式细胞术(FACS)检测其CD44、CD24、EpCAM(CD326)和CD133等肿瘤干细胞标志物的表达情况。
2、胃癌细胞系中胃癌干细胞的分离、培养和鉴定研究:
①以CD44为胃癌干细胞的表面标志物，用流式细胞分选术分离、富集CD44+/CD44-细胞;
②用Real-time PCR方法检测CD44+/CD44-细胞中CD44、Wnt2、Bmi1、Notch1、Oct4、Sox2、Nanog、C-myc、ABCG2和CXCR4等干细胞相关基因的表达情况;
③体外无血清微球体(gastric-sphere)培养和诱导分化实验检测CD44+细胞的自我更新和分化能力;
④体内裸鼠皮下接种成瘤实验检测CD44+/CD44-细胞的致瘤能力。
3、胃癌干细胞标志物在胃癌组织中的表达及其临床意义的研究:分别收集75例胃癌组织、68例癌旁组织和10例正常胃粘膜，用免疫组化方法检测CD44和OVA66在不同胃组织中的表达情况，并分析两者阳性表达的临床意义。
4、胃癌细胞系中胃干/祖细胞标志物的表达研究:用逆转录PCR(RT-PCR)和real-time PCR方法检测胃癌细胞MKN-45以及CD44+/CD44-MKN-45细胞中Lgr5、Villin、TFF2、Mist1和Dclk1等胃干/祖细胞标志物的表达。
结果:
1、胃癌干细胞表面标志物表达的研究:在4种人胃癌细胞系中都有CD44的表达，MKN-45细胞中CD44的表达率高达80％，NCI-N87细胞中高达99％，KATOⅢ细胞为35％，AGS细胞则低于10％，其他肿瘤干细胞标志物在不同胃癌细胞系中的表达率也各不相同。
2、胃癌干细胞的分离、培养和鉴定研究:
①MKN-45和NCI-N87细胞能在无血清培养基中增殖形成微球体，KATOⅡI和AGS细胞则不能;
②将MKN-45细胞通过FACS分选后，其CD44+细胞的纯度可达96％左右;
③CD44+ MKN-45细胞高表达CD44、Wnt2、Bmi1、Notch1、Oct4、Sox2、Nanog、C-myc、ABCG2和CXCR4等干细胞相关基因和新的肿瘤干细胞相关基因OVA66;
④与CD44-细胞相比，CD44+细胞具有更强的微球体形成能力;微球体经诱导分化后，其CD44的阳性率下降，而MUC5AC的表达明显增加;
⑤CD44+细胞的成瘤能力明显高于CD44-细胞，3×102个CD44+细胞即可在裸鼠皮下形成移植瘤，成瘤率为37.5％(3/8)，3×103个和3×104个CD44+细胞的成瘤率分别为62.7％(5/8)和100％(8/8)，而CD44-细胞成瘤能力弱，仅在3×104组中有1只裸鼠成瘤。
3、胃癌干细胞标志物在胃癌组织中的表达及其临床意义的研究:
①CD44和OVA66在胃癌、癌旁组织和正常胃粘膜中的表达率分别为62.7％(47/75)、8.8％(6/68)、0(0/10)和85.3％(64/75)、10.3％(7/68)和0(0/10)，胃癌组CD44、OVA66的阳性表达率均显著高于癌旁组和正常胃粘膜(P＜0.01);
②CD44的表达程度与胃癌的分化程度和临床分期有关(P＜0.01)，OVA66的表达程度仅与胃癌的临床分期呈正相关(P＜0.05);③CD44、OVA66阳性患者的生存期均明显短于CD44、OVA66阴性的患者(P＜0.01)。
4、胃癌细胞系中胃干/祖细胞标志物的表达研究:
①MKN-45细胞表达Lgr5、TFF2和Mist1胃干/祖细胞基因。
②CD44+ MKN-45和CD44- MKN-45细胞均表达胃干细胞基因Lgr5，但表达量无明显差异。
结论:
1、肿瘤干细胞标志物在不同胃癌细胞系中存在着表达，但表达率有所不同。
2、在胃癌细胞系中，CD44可以作为胃癌干细胞的表面标志物;CD44+MKN-45细胞高表达“Stemness”基因，具有肿瘤干细胞的分子特征;CD44+细胞具有自我更新、分化能力和高致瘤能力，具有肿瘤干细胞的功能特征。
3、CD44、OVA66在胃癌干细胞中都有高表达，可作为识别胃癌干细胞的生物标志物;而且CD44、OVA66在胃癌组的表达率均显著高于癌旁组和正常胃粘膜，因此联合检测CD44和OVA66在胃癌预警和早期诊断中有重要的临床意义;CD44、OVA66阳性患者的生存期明显短于CD44、OVA66阴性患者的生存期，提示CD44、OVA66阳性患者的预后不良。
4、胃癌细胞系中也表达胃干/祖细胞标志物，提示胃癌可能起源于胃干/祖细胞，但干细胞基因Lgr5在CD44+胃癌干细胞和CD44-分化肿瘤细胞中的表达量并无明显差异，因此Lgr5可能不是胃癌干细胞的一个分子标志物。