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研究背景及目的:临床上发现除病毒性肝炎以外的其它原因导致的肝损伤病人日渐增多,主要包括药物性肝损伤(Drug induced liver injury,DILI)、原发性胆汁性胆管炎(Primary biliary cholangitis,PBC)、自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis,AIH)等。药物性肝损伤,原发性胆汁性胆管炎及自身免疫性肝炎这三种疾病的临床表现相似,常常需要鉴别诊断。以上疾病的诊断金标准都需要肝组织活检。药物性肝损伤是指由药物本身或其代谢产物引起的肝损伤,也称为药物性肝炎。目前已知,数以千计的药物可引起肝损伤或有潜在的肝毒性;很多药物的赋形剂、中草药以及保健药亦有导致肝损伤的可能。我国目前报道的药物性肝损伤发病率,急性药物性肝损伤约占急性肝损伤住院比例的20%。药物性肝损伤没有特异的临床征象或标志,其临床表现可从无症状、轻微、非特异性的生化改变到急性肝功能衰竭。临床诊断存在困难,因此需要研究药物性肝炎诊断的确切指标。原发性胆汁性胆管炎和自身免疫性肝炎是两种由于自身免疫系统紊乱导致的自身免疫性肝病。由于多样的临床表现和实验室检查结果,原发性胆汁性胆管炎和自身免疫性肝炎的诊断具有挑战性。原发性胆汁性胆管炎和自身免疫性肝炎的诊断需要结合临床特点,肝生化功能异常,自身抗体和肝组织学异常。然而,肝脏生化功能和自身抗体水平也不是诊断疾病的金标准。肝组织学检查由于存在创伤性,临床上不容易被患者普遍接受,此外,不典型的肝脏组织学容易混淆诊断。针对药物性肝炎、原发性胆汁性胆管炎和自身免疫性肝炎临床缺乏有效诊断标志物的情况,结合目前日益成熟的代谢组学技术,包括非靶标代谢组学(即全轮廓代谢组学)及靶标代谢组学技术,我们希望应用代谢组学方法研究这些疾病的发病机制及寻找可以代替肝组织活检的替代(Surrogate)指标。我们应用了非靶标代谢组学及胆汁酸靶标代谢组学的方法,来探索这几种疾病的代谢组学特征,进而探索研究药物性肝损伤、原发性胆汁性胆管炎和自身免疫性肝炎的潜在的诊断标志物,旨在找到无创、可靠、敏感的诊断指标。方法:1.基于超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)血清代谢组学技术分析38例药物性肝损伤和30例健康对照者血清样品,鉴定相关的代谢产物、代谢途径,分析药物性肝损伤中不同损伤程度的疾病组的代谢变化、相关代谢通路和组间差异,并采用选择性反应监测(Select reaction monitoring,SRM)对15种靶向胆汁酸代谢产物进行了定量分析,用ROC曲线分析筛选,找出与药物性肝损伤诊断及药物性肝损伤不同损伤程度有关的差异代谢物,并探讨它们在临床诊断中的应用潜力。2.基于超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)血清代谢组学技术分析54例原发性胆汁性胆管炎、26例自身免疫性肝炎患者和39例健康对照者血清样品,鉴定相关的代谢产物、代谢途径,分析原发性胆汁性胆管炎和自身免疫性肝炎的代谢变化、相关代谢通路和组间差异,并采用SRM法对15种靶向胆汁酸代谢产物进行了定量分析,用ROC曲线分析筛选,找出与原发性胆汁性胆管炎诊断有关的差异代谢物并探讨它们在临床诊断中的应用潜力。结果:1.通过主成分分析(PCA)及偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA),筛选出药物性肝损伤的特征差异代谢物6个。经代谢物鉴定及代谢通路富集分析,甘氨胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、亚油酰胺在药物性肝损伤中水平上升,溶血磷脂酰乙醇胺(18:0/0:0)在药物性肝损伤中水平下降,ROC曲线分析,AUC>0.9,灵敏度及特异度均大于80%,可以作为药物性肝损伤与健康对照组的候选诊断标志物,以上物质在重度肝损伤中,与轻度肝损伤组相比,差异显著,同时可以作为肝损伤严重程度评估的候选标志物,药物性肝损伤的差异代谢物主要参与了初级胆汁酸合成、脂肪酸生物合成及甘油磷脂代谢通路。2.药物性肝损伤胆汁酸SRM代谢组学分析显示,在不同损伤程度的药物性肝损伤组间,甘氨胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸盐、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸在组间有显著差异;同时发现重度损伤的DILI患者血清中石胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸浓度明显低于健康对照组,差异显著,这几种胆汁酸水平的下降与肝损伤的严重程度密切相关。非靶标代谢组学中发现的升高的甘氨胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸及牛磺脱氧胆酸,进一步靶标胆汁酸检测中发现这三种胆汁酸在疾病预测的灵敏度及特异度均大于80%。3.通过主成分分析(PCA)及偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA),我们发现了17种物质在原发性胆汁性胆管炎患者中与正常人相比显著升高,差异显著,有统计学意义;9种原发性胆汁性胆管炎与正常人相比下降的差异代谢物质,差异显著,有统计学意义。12种物质在自身免疫性肝炎与正常人相比升高的物质,差异显著,有统计学意义;12种自身免疫性肝炎与正常人相比下降的差异物质,差异显著,差异有统计学意义。其中甘氨胆酸、甘氨脱氧胆酸盐、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、胆红素、二氢(神经)鞘氨醇、4-羟双氢(神经)鞘氨醇、溶血磷脂酰胆碱(18:3(6Z,9Z,12Z))、溶血磷脂酰乙醇胺(20:3(11Z,14Z,17Z)/0:0)在原发性胆汁性胆管炎及自身免疫性肝炎中均呈上调的表现;12-酮氧基胆酸、焦谷氨酸、乳酸、次黄嘌呤、溶血磷脂酰乙醇胺(0:0/20:2(11Z,14Z))及单甘油酯均呈下调的表现。原发性胆汁性胆管炎及自身免疫性肝炎具有相似的代谢改变,即代谢特征。原发性胆汁性胆管炎中共有12个代谢物曲线下面积大于0.8,前3位代谢物分别为牛磺胆酸、牛磺熊去氧胆酸及LysoPC(18:3(6Z,9Z,12Z)),这些物质与健康对照组相比,其敏感性可达80%以上,特异性可达90%以上。自身免疫性肝炎中共有11个代谢物曲线下面积大于0.8,前3位代谢物分别为溶血磷脂酰胆碱(18:3(6Z,9Z,12Z))、溶血磷脂酰乙醇胺(0:0/20:2(11Z,14Z))及焦谷氨酸,这些物质与健康对照组相比,其敏感性可达80%以上,特异性可达80%以上。原发性胆汁性胆管炎及自身免疫性肝炎的差异物质主要集中在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、初级胆汁酸合成及磷酯类代谢这几个代谢通路上。两组疾病的大部分代谢物相同,都影响了氨基酸、胆汁酸、脂质、能量的代谢。4.原发性胆汁性胆管炎及自身免疫性肝炎胆汁酸SRM代谢组学分析显示,所有的胆汁酸在疾病组都呈升高改变,原发性胆汁性胆管炎组胆汁酸与自身免疫性肝炎组胆汁酸相比,鹅脱氧胆酸,石胆酸,牛磺石胆酸与石胆酸之和在两组间有显著性差异,差异有统计学意义。甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸硫酸盐、牛磺脱氧胆酸及牛黄结合胆汁酸水平随着Child-puph分级程度的增加,其水平亦逐渐增加,以上胆汁酸的水平与疾病严重程度相关,提示结合型胆汁酸与疾病严重程度相关。甘氨鹅脱氧胆酸与牛磺脱氧胆酸与药物性肝炎中疾病损伤程度的变化相同。5.胆汁酸SRM代谢组学在药物性肝损伤,原发性胆汁性胆管炎、自身免疫性肝炎及健康对照组分析显示:鹅脱氧胆酸在药物性肝损伤中的水平高于其他三组,差异显著,有统计学意义;同时石胆酸在PBC中的水平高于其他三组,差异显著,有统计学意义;石胆酸与牛磺石胆酸的和在PBC中的水平高于其他三组,差异显著,有统计学意义。结论:1.本研究应用代谢组学方法,包括非靶标和胆汁酸靶标代谢组学方法,发现了药物性肝损伤,原发性胆汁性胆管炎及自身免疫性肝炎等病人血清中代谢物质存在差异。这些差异既存在于疾病组与健康对照组之间,也存在于上述三种疾病组之间。2.我们发现牛磺脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、亚油酰胺、溶血磷脂酰乙醇胺(18:0/0:0)可以作为药物性肝损伤的潜在诊断指标,同时可以作为药物性肝损伤严重程度评估的候选标志物。鹅脱氧胆酸在药物性肝损伤中明显升高,有望成为药物性肝损伤鉴别诊断原发性胆汁性胆管炎和自身免疫性肝炎的潜在标志物。3.我们发现原发性胆汁性胆管炎和自身免疫性肝炎之间大部分代谢物变化特点相似,富集通路分析其代谢变化的总体趋势基本保持一致。但在胆汁酸、脂类的的代谢物存在明显的异同,甘氨胆酸、牛黄胆酸等物质均升高,溶血磷脂酰乙醇胺(0:0/20:2(11Z,14Z))均下降,鹅脱氧胆酸及石胆酸二者之间有差异,这些发现对于分析两种疾病在发病机制上的异同,对于两种疾病之间的鉴别诊断有重要意义。4.石胆酸,石胆酸与牛磺石胆酸的和在原发性胆汁性胆管炎中明显升高,有望成为可以用来鉴别自身免疫性肝炎及药物性肝损伤的潜在标志物,具有较好的临床应用潜力。