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甾体药物（简称甾药）是仅次于抗生素的第二大类药物，在医药界有“稳如磐石不可或缺”之誉。利用分枝杆菌等微生物转化甾醇生成甾药中间体，是目前最为先进的甾药制备技术，已日渐替代传统的皂素合成工艺成为当今甾药生产的主流。分枝杆菌代谢甾醇的机制十分复杂，至今仍有大量关键环节有待研究，由于对甾醇代谢机制认知的匮乏，造成高效生产菌种的研发十分困难，虽然该技术已有四十多年的应用历程，但仍存在一些根深蒂固的难题需要改进，例如母核降解、副产物多和转化效率低等，严重限制了甾体制药工业的快速发展。基于此，本论文致力于解析分枝杆菌代谢甾醇过程中的一些关键环节，并结合已有研究成果，探索开发高效生产菌株的代谢工程改造策略。本文具体的研究工作如下: 1、甾体侧链C22-C23裂解过程的解析及C22甾药中间体的制备 C22甾药中间体是一类重要的甾药前体，可用于合成孕激素和肾上腺皮质激素等甾药，其母核结构完整，C17位上留有3个C原子侧链，因此其合成与甾醇母核和侧链的代谢密切相关。本论文在Mycobacterium neoaurum ATCC25795中成功锁定并鉴定了一个双功能酶Hsd4A，该酶同时具有17β-羟基甾体脱氢酶和β-羟酰-CoA-脱氢酶活性，参与甾醇母核和侧链的代谢过程，该基因的缺失会导致C22代谢中间体的积累。通过对hsd4A和甾醇母核代谢关键基因3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因kstD和3-甾酮-9α-羟基化酶基因kshA的联合调控，我们成功构建了可分别生产C22甾药中间体1，4-HBC(22-羟基-23，24-双降甾-1，4-二烯-3酮)、4-HBC（22-羟基-23，24-双降甾-4-烯-3酮）和9-OHHBC（9，22-二羟基-23，24-双降甾-4-烯-3酮）的高产工程菌株，所得菌株转化40g/l植物甾醇，可分别积累18.23 g/l1，4-HBC、15.75 g/l4-HBC和10.72 g/l9-OHHBC，其中1，4-HBC和4-HBC的液相选择率高达90％。在上述工作的基础上，我们推导出一条有别于传统雄甾烯酮AD-pathway的新甾醇代谢支路，即HBC-pathway。甾醇侧链降解HBC-pathway和AD-pathway的共存，阐释了工业生产过程中C19中间体生产菌生成C22副产物的原因，HBC-pathway的发现为理性改良C19中间体的工业生产菌种奠定了基础，且开创了理性研发C22中间体生产菌的先河。通过组合改造hsd4A等基因，本课题组在国内外率先成功开发了高品质的HBCs生产菌株，并已在企业实现了工业化生产。 2、C19甾药中间体高效生产菌株的构建 C19雄甾烯酮是另一类较为常见的重要甾药前体，可用于性激素和肾上腺皮质激素等甾体类药物的生产。从结构上看，C19甾药中间体保留了甾醇母核完整的A、B、C、D四环，C17位上的侧链则被完全降解。因此C19甾药中间体的构建需保证甾醇侧链代谢的顺利进行，同时阻断甾醇母核的降解。分枝杆菌甾醇母核代谢的关键酶为3-甾酮-Δ1-脱氢酶(KstD)和3-甾酮-9α-羟基化酶(KSH)，其中3-甾酮-Δ1-脱氢酶可作用于母核A环C1，2位的脱氢，3-甾酮-9α-羟基化酶可作用于母核B环C9位的羟基化，这两个反应共同促使甾醇母核发生开环。本论文从M.neoaurum ATCC25795原始菌株出发，删除了两个KSH编码基因kshA1和kshA2，同时强化一个KstD编码基因kstD1，构建了一株可以生产ADD（雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮）的菌株，该菌株除主产物ADD外，还积累了相当量的C22杂产物1，4-HBC。如前所述，C22杂产物的积累可能是由于侧链降解途径HBC-pathway的存在，因此我们在该ADD生产菌中进一步强化了hsd4A基因，加强AD-pathway代谢流，减弱HBC-pathway。构建获得的XIIp261kstD1-hsd4A菌株成功的减少了1，4-HBC的积累（4.02-4.61 g/l减少至2.52-3.17 g/l），该菌株可转化20g/l植物甾醇生成9.36 g/l ADD，液相选择率高达约93％。同时，本论文通过在M.neoaurum ATCC25795菌株中3-甾酮-Δ1-脱氢酶和3-甾酮-9α-羟基化酶活性的共同缺失，构建了可以生产AD（雄甾-4-烯-3，17-二酮）的菌株。相似的，在该菌株中可检测到C22杂产物4-HBC的积累，我们通过在该菌株中hsd4A基因的强化成功减少了4-HBC的生成，获得的XIIΔkstD123-p261 hsd4A菌株可转化20 g/l植物甾醇生成8.03 g/lAD。 3、谷内酯HIL生产菌株的构建 谷内酯HIL是甾醇母核A/B环和侧链发生降解，而C/D环保持完整的一类甾药前体，可用于19-去甲基甾体类药物如米非司酮、苯丙酸去甲睾酮的生产。HIL生产菌研发的关键在于阻断甾醇母核C/D环的降解。C/D环降解代谢相关酶受KstR2调控子调控。因此本论文对KstR2调控区域内的多个基因，酰基-CoA连接酶基因fadD3、酰基-CoA脱氢酶基因fadE30、fadE31、fadE32、fadE33、硫解酶基因fadA6进行了功能筛选，鉴定出脱氢酶基因fadE33是阻断C/D环降解生成HIL的关键酶基因。在此基础上，构建了脱氢酶基因缺陷菌株MNΔE313233，该菌株可转化20 g/l植物甾醇生成4.1 g/l HIL，气相选择率高达约98％，相关成果具有创新性。 综上所述，本论文通过多种分子生物学、代谢工程手段，揭示了分枝杆菌代谢甾醇生产有用代谢产物的多步关键机制，实现了甾醇代谢通路的可控改造，获得了种类丰富的C19、C22和HIL等中间体的工程菌种。本论文的突出贡献在于在国内外率先实现了以理性代谢工程的策略成功开发高产C22和HIL的生产菌种，对进一步改良相关工业菌种具有重要的借鉴意义。