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20世纪60年代,瑞典学者Branemark教授提出“骨整合”（osteointegration）的概念,为口腔种植学奠定了理论基础。现在,我国的很多口腔医院、诊所都已经开展了口腔种植修复治疗项目,很多的患者通过种植治疗完成了各种牙列缺损的修复。绝大多数口腔医生认同口腔种植修复是现代口腔临床医疗技术中最先进、同时也是最具有发展潜力的技术之一。口腔种植修复与其它口腔修复治疗手段具有相同的治疗目的:不仅要求修复体能够具有良好的固位性能,更要求修复体具有良好的抗力效果,也就是说要求修复体能够提供足够的咬合力,行使咀嚼功能;同时,还要求修复体在外形上满足患者的美观要求。要达到上述治疗效果的前提是种植体能与周围骨组织形成良好的骨整合,如何加快骨整合的速度,缩短种植体-骨界面的愈合时间,从而实现种植体的早期抗力甚至于即刻抗力成为现阶段口腔种植领域的研究热点。近年来随着临床用药物的发展,出现了很多可以促进骨整合的药物,尤其以近30年来发展起来的一类新药——二膦酸盐类药物,效果最为显著。其具有较强的促进成骨和增加种植体-骨接触率等作用。口腔种植体因具有其特殊的组织环境及力学条件而区别于其它种植体,尤其要求种植体能够早期愈合,早期抗力。研究表面含有可促进骨整合药物的羟基磷灰石涂层口腔种植体,具有极高的临床应用前景、将可以极大的提高口腔种植治疗的临床效果。基于以上原因,在本课题中筛选并鉴定药物促进口腔有成骨能力的细胞增殖过程中起调控作用的miRNA分子,验证这些miRNA分子对成骨细胞增殖分化等功能的调控作用;选取目前临床上应用最为广泛的“三代”二膦酸盐类药物——伊班膦酸钠作为研究对象,通过体外实验证实伊班膦酸钠对于口腔有成骨作用的细胞的促增殖,利成骨及促进细胞在钛膜上粘附、成骨的作用;通过鉴定候选miRNA分子的可能靶基因,明确这些miRNA分子调节的信号通路,阐明候选miRNA在伊班膦酸钠存在时对口腔有成骨能力的细胞功能的影响。本文中的研究内容和结果如下:1.伊班膦酸钠（Ibandronate）对口腔内有成骨能力的细胞生物学功能的影响。为了验证Ibandronate对口腔有成骨能力的细胞增殖的影响,我们首先用MTT试验检测了Ibandronate在不同浓度下对PDLSC、SHED细胞增殖的影响。结果表明,Ibandronate以剂量依赖性的方式影响PDLSC和SHED细胞的增殖。当Ibandronate在相对较高浓度时,如10-3M时,Ibandronate能够抑制PDLSC细胞的增殖,当Ibandronate浓度在10-6到10-10M浓度范围内时,Ibandronate明显促进PDLSC细胞的增殖。Ibandronate的浓度在10-8M时,对PDLSC细胞增殖的促进作用最强,与对照相比增幅高达25%。当Ibandronate浓度为小于10-11M时,对PDLSC细胞增殖则观察不到明显影响。在Ibandronate作用的SHED细胞观察到了相似的变化。我们用qRT-PCR检测了成骨相关基因的表达。ALP,COL-1,osteoprotegerin（OPG）,OC和Runx2等成骨相关基因的表达可以显示PDLSC细胞的成骨分化状态。我们的结果显示Ibandronate能够影响这些基因的表达,其中ALP的表达是成骨分化的一个早期的指标。我们分别于10-8M的Ibandronate作用于PDLSC细胞4,8,12和24h后提取总RNA,检测ALP mRNA水平的表达情况。结果表明ALP水平在Ibandronate作用后呈现上调,在8h时达到顶峰。其它影响PDLSC成骨分化状态的基因则分别于Ibandronate作用后的12,24,48h进行检测。结果,COL-1,OPG,OC和Runx2的mRNA水平也发生了上调。2.伊班膦酸钠能引起成骨细胞miRNA表达谱的改变。为了揭示Ibandronate对microRNA这种功能广泛的人类基因的小调控分子的影响,我们首先对近年来发表的与成骨分化有影响的microRNA分子进行筛选,发现microRNA中的miR-125b,miR-141,miR-135等分子参与了成骨分化的调控。然后我们用10-8M的Ibandronate作用于PDLSC,SHED和鼠颅骨原代细胞24h后,采用qRT-PCR方法检测microRNA分子的表达情况。结果发现,在PDLSC细胞,miR-18a和miR-130a被Ibandronate上调,其它microRNA分子则下调;在SHED细胞,miR-18a和miR-133a分子表达上调,其它microRNA分子则下调;在鼠颅骨原代细胞上调的分子包括miR-18a,miR-133a,miR-133b,miR-19a,miR-196a,miR-211,miR-200a,miR-200b,这说明Ibandronate作用于有成骨能力的细胞并使其影响microRNA的表达谱发生改变,进而对其成骨分化过程进行调控。3.伊班膦酸钠对有变化的miRNA靶基因的影响。为了进一步揭示伊班膦酸钠对相关成骨细胞miRNA靶基因的影响,我们对文献报道中可能参与成骨分化的microRNA的靶基因进行筛选,最后选取miR-125b,miR-133,miR-135b,miR-141和miR-26a作为目的靶基因,采用RT-PCR方法对它们的表达水平进行了检测。结果表明,这些基因的表达呈现时间依赖性地上调,其表达与相应microRNA分子的表达刚好正反,也印证了microRNA分子可能对这些分子进行mRNA水平的负调控。4.伊班膦酸钠对细胞在钛膜上粘附、成骨的影响。为了证实伊班膦酸钠对细胞在钛膜上粘附、成骨功能的影响,我们将PDLSC细胞与400#1500#的不同打磨程度的钛片或是用40#或80#氧化铝颗粒喷砂处理的钛片共同孵育,并在系统中加入或不加入Ibandronate,在30min,60min和120min检测细胞在钛片上的粘附情况。细胞粘附检测结果表明,在细胞接种的早期PDLSC细胞对不同粗糙程度的钛片表面的粘附程度是不同的,与对照相比,粗糙的钛片表面更利于PDLSC细胞的粘附,而Ibandronate能够促进PDLSC细胞在钛金属表面的粘附,但120min以后,在不同钛片表面细胞的粘附率没有明显差异。细胞增殖能力检测结果表明,钛片表面的光滑程度对细胞的增殖有一定的影响,光滑表面可能更利于细胞的增殖,而Ibandronate能够明显促进细胞在不同钛片表面的增殖,Ibandronate存在下PDLSC细胞在钛片表面形成了良好的粘附,细胞充分伸展,有很多丝状突起,具有旺盛的增殖活性,说明Ibandronate提高了纯钛与PDLSC细胞的生物相容性,促进PDLSC细胞的铺展。间接免疫荧光染色检测发现,Ibandronate能够促进PDLSC细胞在钛片表面的粘附,通过对其细胞核及肌动蛋白actin的染色可以看到随着钛片表面光滑度的提高,粘附的细胞量也在增多,而Ibandronate组与未刺激组相比粘附的细胞量较多,说明Ibandronate能够促进PDLSC细胞在钛片表面的粘附。