【摘 要】
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鹿茸是哺乳动物器官在失去后还能完全再生的惟一器官,是研究哺乳动物器官再生及创伤修复的理想动物模型。研究表明鹿茸发生和再生都是依赖干细胞的过程。鹿茸的干细胞存在于
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鹿茸是哺乳动物器官在失去后还能完全再生的惟一器官,是研究哺乳动物器官再生及创伤修复的理想动物模型。研究表明鹿茸发生和再生都是依赖干细胞的过程。鹿茸的干细胞存在于鹿未来鹿茸发生区的骨膜中,即生茸区骨膜(AP)中。AP细胞表达特有的分子S100A4,推测为鹿茸发生的关键调节分子。进一步从分子水平阐述S100A4在鹿茸发生中的调节机制需要高质量S100A4的纯品。本实验针对已从梅花鹿AP细胞反转录出的S100A4基因序列,设计了含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的上下游引物,并扩增出了目的基因片段。片段大小为330bp,所选用的表达载体为PGEX-6P-1。分别用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切已扩增出的S100A4基因片段和PGEX-6P-1载体,将酶切后的目的片段和载体进行切胶回收。使用T4连接酶将两者进行连接,将连接产物转入Top10F’感受态细胞中,通过氨苄青霉素抗性的LB平板筛选阳性菌落,并进行PCR和双酶切鉴定,并对阳性菌株进行测序。提取连接正确的重组质粒,并将重组质粒转入BL21(DE3) pLys S感受态细胞中,筛选阳性单克隆菌株。对得到的菌株进行异丙基硫代半乳糖苷(ⅠPTG)诱导表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot鉴定表明S100A4-GST融合蛋白成功表达。通过超声波破碎的方法裂解大肠杆菌,离心去除沉淀,取上清,进行SDS-PAGE电泳,表明该融合蛋白为可溶性表达。大量诱导表达融合蛋白,并用GST纯化柱对融合蛋白进行了纯化。本实验成功地在体外表达了梅花鹿鹿茸干细胞S100A4-GST融合蛋白,并纯化了该蛋白。为下一步研究S100A4蛋白在鹿茸发生机制中所发挥的作用提供了条件。
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