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生长在自然环境中的植物,由于固着在土地中不得不承受由环境变化而引起的各种胁迫,包括高温、低温、高盐、干旱等。为了更好的适应环境,植物自身产生一套复杂的调控网络。人们则通过种质资源的筛选和转优良抗逆基因来获得或创造具有更强环境适应性的植物素材。这两种方法是密切相关的,首先通过筛选获得抗逆性优良的种质资源,然后从其克隆到优良的抗逆基因,最后将获得优良抗逆基因通过转基因等技术进行聚合而创造出环境适应性更强的植物育种素材。因此,优良的抗逆性种质和基因资源对抗逆育种都是具有重要作用。桑树是多年生木本植物,长期以来被作为家蚕饲养的唯一天然饲料来源。然而,除了这种单一的经济价值,桑树也具有极高的生态价值,如利用桑树具有耐旱、耐盐、耐涝等重要环境适应能力,开展生态脆弱地区治理,如土地沙漠化、石漠化、盐碱化治理以及矿山生态修复等。由于传统的桑树栽培学对桑树的环境适应性研究相对薄弱,严重制约了桑树应用于生态治理及其生态价值的实现,因此,系统开展桑树的抗逆性特别是包括耐盐耐旱性的非生物抗逆性研究,筛选抗逆性强的桑树种质资源、品种资源或杂交组合,已成为蚕桑产业的转型升级和生态桑产业发展的迫切需求。随着基因组时代的到来,从基因层面研究桑树的抗逆性已成为必然。川桑全基因组测序的完成开启了桑树分子研究的新时代。但是,目前关于桑树抗逆性基因的研究还相对较少,对于DREB类转录因子的研究更是鲜有报道。并且,DREB虽已从多种植物中分离鉴定出,但是木本植物中及A-3-A-6亚家族的DREB基因的研究还较少。对于桑树DREB类基因功能的研究将有助于补充桑树抗逆基因研究的缺失,也将有利于完善DREB类基因在木本植物中研究的不足。基于以上问题,本研究就从种质资源筛选和基因功能研究两个方面着手,获得具有高抗性的桑树种质资源和优良基因。首先,本研究收集抗性好的策沙系列和桂桑优系列的13个杂交组合,并以此为基础对其耐盐性和耐旱性进行研究。其次,本研究在前期研究的基础上,通过胁迫诱导表达谱,筛选出抗性优良的基因MnDREB4A,并从信息分析,亚细胞定位分析,启动子活性分析和基因功能分析几个方面来研究基因的功能。本研究所获得的研究结果如下：1.13份桑树杂交组合F1代的耐盐性和耐旱性鉴定采用高浓度(12g/L)NaCl溶液对13份供试桑树杂交组合的F1种子萌发进行盐分胁迫处理,以第6天的数据分析相对发芽率、发芽势、发芽指数和盐害指数等性状。采用五级评分法,对13个桑树杂交组合的耐盐性进行综合评价,并根据总评分划为四种耐盐类型：策沙-杂6、策沙-杂5和桂桑优62为极耐盐类型；桂桑优12,策沙-杂1、策沙-杂11、策沙-杂4、策沙-杂7为高耐盐类型；策沙-杂2为中度耐盐类型；策沙-杂8、策沙-杂10、策沙-杂13、策沙-杂12为对盐分敏感类型。用400g/L的PEG6000培养液处理幼苗,根据处理4d后各杂交组合的幼苗成活率将其耐旱性分为四种类型：策沙-杂6和策沙-杂12为极耐旱类型；策沙-杂4、策沙-杂5、策沙-杂8、桂桑优12、策沙-杂13为高耐早类型；策沙-杂1、策沙-杂11、策沙-杂10、桂桑优62为中度耐旱类型；策沙-杂2、策沙-杂7为干旱敏感类型。对13个供试桑树杂交组合的F1耐盐性和耐旱性进行排序,对并其生态应用作出推测：策沙-杂6的耐盐性和耐旱性都极好适合在长期干旱并且盐碱化较为严重的地区种植；策沙-杂12为对盐分敏感而又极耐干旱的类型,适合用于荒漠化及矿山地区植被恢复；桂桑优62为极耐盐而耐旱性却较差的类型,可应用于滨海滩涂盐碱化地区的植被和生态恢复。2. MnDREB4A基因克隆和生物信息学分析根据桑树DREB基因的非生物胁迫诱导表达谱,我们筛选出DREB4A基因作为后续研究的基因。通过生物信息学分析发现,MnDREB4A与其他植物中相应蛋白序列的序列相似性较高,尤其是在AP2结构域处,并且都具有识别和结合DNA所必须的位点,如YRG、WLG、 RAYD、V14(缬氨酸)和E19(谷氨酸)。SWISS-MODEL预测MnDREB4A形成了DREB类转录因子所特有的3个β折叠和1个α螺旋的蛋白质结构。PlantCARE在线预测MnDREB4A基因上游1500bp所含的顺式作用元件,显示它的启动子上含有与非生物胁迫相关的顺式作用元件,暗示了MnDREB4A基因与非生物胁迫有关。通过两个网站的预测,MnDREB4A蛋白是定位于核中的。以上的生物信息学的分析表明MnDREB4A基因可能在桑树抗旱方面具有重要的作用。3. MnDREB4A基因功能研究采用农杆菌介导的洋葱表皮瞬时转化,将35S启动子介导的MnDREB4A::EGFP, EGFP::MnDREB4A和EGFP的表达框转入洋葱表皮细胞中。通过在荧光显微镜下的观察表明,MnDREB4A::EGFP和EGFP::MnDREB4A主要分布在细胞核,说明MnDREB4A是定位于核中的蛋白质。将MnDREB4A基因的启动子与标记基因GUS连接(MnDREB4A pro::GUS)并通过农杆菌导入拟南芥中,用高温(40℃)、低温(4℃)、高盐(150mM NaCl)和干旱(20%PEG6000)四种胁迫处理获得的转基因拟南芥,结果显示MnDREB4A基因的启动子能够响应这四种胁迫,并且随着处理时间的延长,GUS的表达量增加,基本都在12h时达到了峰值,并逐渐开始下降。在未受到胁迫时,GUS分布呈现出了一定的组织特异性——主要分布在脉管中。通过叶盘转化法,将35S启动子启动的MnDREB4A基因表达框导入到烟草(Nicotiana tabacum L.)基因组中。从表型上看,野生型的烟草叶片较大,颜色淡绿,而转基因烟草的叶片相对较小,颜色也呈现较深的绿色,叶片的保水能力显著高于野生型；转基因烟草的根系比野生型密且长一些。在植株实验和叶片实验中,经过低温、高温、高盐和干旱四种胁迫处理后,转基因株系和叶片黄化和萎蔫程度明显低于野生型。取处理后植株的叶片测定脯氨酸、丙二醛和相对含水量,结果显示,转基因系植株的四种处理的相关指标均显著不同于野生型植株,转基因株系表现出更好的抗逆性。NtERD10B, NtERD10C, NtERD10D是与植物失水相关的基因,NtHSP70, NtHSF2是与高温有关的基因,NtLEA5是信号转导相关的基因,与多种胁迫相关。通过荧光定量PCR的方法,测定这些相关基因在野生型和转基因系烟草中的表达量,结果显示,这些基因在转基因系烟草中均表现出了显著下调的趋势。这也暗示MnDREB4A基因是通过调控下游相关基因的表达而提高植物对非生物胁迫的耐受性。