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研究背景宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤,是威胁广大发展中国家女性生命健康的重要疾病。宫颈癌一旦发生远端转移,将严重影响患者的生存率和治愈效果。因此,宫颈癌转移机制的研究被持续重点关注。RNA聚合酶2第五亚基(RPB5)作用蛋白RMP,即非经典前折叠素RPB5作用因子URI具有癌蛋白的特性,本课题组的前期研究显示在体外,URI能够促进宫颈癌细胞的迁移,但具体机制不明,推测可能与细胞骨架波形蛋白(Vimentin)有关。在前期研究工作的基础上,本研究以宫颈癌细胞株He La和C33A为研究对象,通过干预URI和Vimentin的表达,进一步探讨URI对宫颈癌细胞迁移和侵袭的作用及机制,并探讨URI与Vimentin之间的关系。研究目的本研究主要有三个目的:(1)探究URI对两株宫颈癌细胞He La和C33A迁移和侵袭的生物学行为的作用。(2)揭示URI对宫颈癌细胞运动能力的影响是否与Vimentin有关。(3)探索URI对Vimentin调控的潜在机制。研究方法(1)采用q RT-PCR和western blot检测两株宫颈癌细胞中URI的基础表达水平,然后在He La和C33A细胞中,运用化学转染试剂分别转染URI特异性si RNA、URI表达质粒PCMV6-URI以构建URI干扰和过表达细胞株。(2)运用Transwell小室实验检测URI敲低或过表达后细胞的迁移和侵袭能力。(3)在He La和C33A细胞中,分别敲低或过表达URI后运用q RT-PCR和western blot检测分析Vimentin的表达情况。(4)在URI干预的宫颈癌细胞中,分别用TGF-β、Vimentin特异性si RNA诱导或敲低Vimentin表达后观察细胞的运动能力。(5)将Vimentin基因上游启动子序列克隆到带有荧光素酶报告基因的p GL3/Basic载体中,通过与URI表达质粒共转染293T细胞,荧光素酶报告实验检测URI对Vimentin启动子活性的影响。(6)使用染色质免疫共沉淀(Ch IP)实验分析URI在Vimentin基因启动子区域的可能结合情况。研究结果(1)两株宫颈癌细胞URI基础表达水平和细胞转染研究:q RT-PCR和western blot检测结果显示,He La细胞URI的基础表达水平比C33A细胞高。转染URI特异性si RNA后,He La细胞URI的m RNA和蛋白表达水平明显低于对照组,而转染URI表达质粒PCMV6-URI后,C33A细胞URI的m RNA和蛋白表达水平明显高于对照组。(2)干预URI可影响细胞迁移和侵袭能力:Transwell小室迁移实验显示,在He La细胞中,URI干扰组比对照组细胞迁移穿过小室的数目明显减少:在C33A细胞中,URI过表达组比对照组细胞迁移穿过小室的数目明显增多。Transwell小室侵袭实验显示,同对照组相比,URI干扰后He La细胞侵袭穿过小室的数目明显减少;而过表达URI后C33A细胞侵袭穿透小室的数目明显增多。(3)干预URI可调控Vimentin的表达:q RT-PCR和western blot检测表明,同对照组相比,URI干扰后,He La细胞内Vimentin的m RNA和蛋白表达水平表达都下降;URI过表达后,C33A细胞内Vimentin的m RNA和蛋白表达水平都增加。(4)URI对细胞迁移和侵袭能力的影响同Vimentin有关:Transwell小室迁移实验显示,在URI干扰的He La细胞中,经10ng/ml TGF-β处理后,细胞迁移穿过小室的数目比未处理组多;在URI过表达的C33A细胞中,经Vimentin特异性si RNA转染后的,细胞迁移穿过小室的数目比对照组少。Transwell小室侵袭实验显示,在URI干扰的He La细胞中,10ng/ml TGF-β处理组细胞侵袭穿过小室的数目明显比未处理组多;在URI过表达的C33A细胞中,Vimentin特异性si RNA转染组细胞侵袭穿过小室的数目明显比对照组少。(5)URI可间接活化Vimentin启动子活性:在293T细胞中,荧光素酶报告实验结果显示URI过表达组的荧光素酶活性比对照组增强了约1.57倍,但在He La和C33A两株宫颈癌细胞中,运用染色质免疫共沉淀实验分析,q PCR结果显示URI蛋白在Vimentin启动子各区域结合情况同阴性对照组相比没有统计学差异。结论(1)URI可促进宫颈癌细胞迁移和侵袭。(2)URI可增强Vimentin的m RNA和蛋白表达。(3)Vimentin有助于URI增强宫颈癌细胞的运动能力。(4)URI可增强Vimentin启动子的活性,但尚无证据表明其可以直接结合到Vimentin启动子上。