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分泌蛋白在病理生理过程中发挥着重要作用,其中有很多已成为分子标记物或治疗疾病的靶点,因此发现新的分泌蛋白并阐明其功能及作用机制具有重要意义。近年新发现的分泌蛋白Metrnl是神经营养调节因子Meteorin的同源蛋白,近十年间,全球多家实验室在不同背景下筛选具有研究潜力的基因和蛋白时,Metrnl基因频频出现,引起了人们注意。本室于2008年利用限食模型寻找新脂肪因子的过程中发现Metrnl,并研究了其对白色脂肪形成和胰岛素敏感性的影响。另外,自2012年首次报道Metrnl蛋白至今,人们还陆续发现Metrnl蛋白参与其他多种生物学过程,包括神经发育、白色脂肪棕色化、骨形成等,但是Metrnl更多的生物学功能（比如在血管系统中的功能）及其作用机制仍有待探索和挖掘。前期本室已证明,Metrnl在白色脂肪组织和胃肠道及皮肤中的表达很高,在脑组织中表达相当低,但是,我们在观察正常人组织芯片Metrnl蛋白免疫组化结果时意外注意到,Metrnl在脑血管的染色很深,在其他组织的血管中亦然,提示Metrnl在血管组织表达很高。于是我们利用QPCR的方法检测了血管Metrnl mRNA的相对水平,发现其在主动脉的表达很高,几乎接近皮下白色脂肪组织。接下来,我们取了去除或保留内皮细胞的主动脉,用QPCR的方法检测两组血管中Metrnl mRNA表达量,又用CD31和Metrnl双抗对两组血管进行免疫荧光和免疫组化实验,结果表明,Metrnl主要高表达于血管的内皮细胞,之后我们还发现小鼠原代内皮细胞和3T3脂肪细胞中Metrnl的表达量相当。此外,我们利用ELISA方法在小鼠原代内皮细胞的孵育液中检测到了Metrnl蛋白,证明了内皮细胞可以分泌Metrnl。我们推测内皮Metrnl很可能在血管系统发挥重要作用,因此,为方便对血管内皮Metrnl的生物学功能及其作用机制展开研究,我们利用Cre-LoxP系统构建了Metrnl血管内皮细胞特异性敲除(EC-Metrnl-/-)小鼠。检测发现,EC-Metrnl-/-小鼠血液Metrnl水平明显低于对照小鼠,只有对照组水平的1/3,说明由内皮细胞合成分泌的Metrnl是血液Metrnl的主要来源之一,可能在Metrnl对机体全身系统的作用中具有重要功能。我们通过胸主动脉离体血管实验对EC-Metrnl-/-小鼠和对照小鼠的血管收缩和舒张反应性进行了考察,发现用去氧肾上腺素诱导血管收缩时,两组小鼠无差异;用乙酰胆碱（ACh）诱导内皮依赖性血管舒张时,EC-Metrnl-/-小鼠胸主动脉的反应性明显下降;用NO供体硝普钠诱导非内皮依赖性血管舒张时,两组小鼠无差异,提示血管内皮细胞Metrnl缺乏可导致内皮功能受损,影响了ACh内皮依赖性血管舒张反应。ACh引起的胸主动脉内皮依赖性血管舒张反应是由eNOS-NO通路介导的,为了了解Metrnl调控内皮功能的机制,我们在体外培养的内皮细胞上检测了Metrnl对这一通路的影响。我们发现,将人脐静脉内皮细胞Metrnl敲减后,在钙离子导入剂A23187刺激下,Metrnl敲减细胞的NO产量减少,且其eNOS Ser1177磷酸化水平下降,而eNOS蛋白水平不变,提示Metrnl调节eNOS翻译后修饰。我们继续用A23187刺激EC-Metrnl-/-小鼠主动脉原代内皮细胞,同样发现Metrnl缺乏后可减弱eNOS Ser1177磷酸化水平。但我们未观察到eNOS相关磷酸化调节蛋白如AMPK,AKT和PP2A等有变化,提示Metrnl可能并不是通过这些信号分子影响eNOS的磷酸化。此外,我们用免疫沉淀方法检测了eNOS相互作用蛋白,发现在内皮细胞缺乏Metrnl时,eNOS与Caveolin 1、Calmodulin或HSP90的相互作用并未改变,但eNOS与微管蛋白tubulin相互作用减弱,而且细胞tubulin mRNA表达量下降、蛋白含量减少;反之内皮细胞过表达Metrnl时,tubulin与eNOS相互作用增强,在A23187刺激下该作用进一步增强。该结果说明,Metrnl可调节血管内皮微管蛋白tubulin的表达,并影响eNOS与tubulin的相互作用,提示细胞微管蛋白可能介导了Metrnl对eNOS活性的调节。内皮失能在动脉粥样硬化（AS）的发生和发展过程中起到重要作用,为进一步揭示内皮Metrnl在心血管系统的功能和意义,我们继续考察了Metrnl对动脉粥样硬化发生发展的影响。我们将EC-Metrnl-/-小鼠与具有AS易感性质的ApoE-/-小鼠杂交,成功构建了内皮Metrnl敲除小鼠的AS模型,发现在内皮Metrnl缺失后,小鼠主动脉AS斑块形成加重,且伴有更严重的主动脉炎症。作为该结果的进一步证明,我们也以同样的方式构建了Metrnl全身敲除小鼠的AS模型,结果亦说明Metrnl的缺乏加剧了AS的疾病严重程度。心肌梗死是动脉粥样硬化最常见的病理后果之一,本课题最后检测了心梗患者血液Metrnl的水平。由于检测人血液Metrnl的方法并不成熟,我们首先对两种商业化的Metrnl检测试剂盒进行了考察和比较,并对相关检测条件进行了探索。此部分研究结果显示,心梗患者血液Metrnl水平与对照组人群比较显著降低。总之,本研究我们首次证明了Metrnl在血管内皮高表达,并通过构建Metrnl内皮细胞特异性敲除小鼠,发现Metrnl缺乏可引起血管内皮功能受损。机制研究表明,Metrnl可以通过调节eNOS的磷酸化来影响内皮NO产量从而调节血管舒张反应,并推测该过程由微管蛋白介导。此外,我们首次发现内皮Metrnl缺乏可加剧动脉粥样硬化的发生发展,Metrnl在心梗患者血液中的水平有所降低。