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随着社会经济的发展,土壤和水污染问题日趋严峻,其中重金属污染是主要的污染因素之一。植物修复具有投资少、效率高、易操作且不破坏环境等优点,被广泛应用到重金属污染水体的修复中。轮叶黑藻(Hydrilla verticillata(L.f.)Royle)广泛分布于淡水湖泊中,被认为是有潜力的修复重金属污染水体的水生植物之一。本研究利用生理学、蛋白质组学和基因组表观遗传学方法,研究了 Cu在轮叶黑藻中的积累和分布特点,以及过量Cu对植株的生理和遗传毒性,为淡水湖泊重金属污染监测与修复提供理想的植物材料和理论依据。在本实验中,过量Cu会显著降低轮叶黑藻生物量。随着Cu处理浓度增加,叶片中的Chla/Chlb比值趋于降低,而在茎中无显著变化。Cu处理下,叶片中O2·-、H2O2与MDA含量增加;同时,POD、APX和GR的活性增加,而AsA/DHA显著降低;而在茎中仅有SOD显著增加。这些结果表明,与茎相比,叶片对Cu胁迫更为敏感,叶片与茎的抗氧化响应存在差异。与对照相比,0.05和0.1 mg L-1 Cu处理降低成熟和幼嫩叶片的Chl a(叶绿素a)、Chlb(叶绿素b)的含量和Chl a/Chlb值,并且在成熟叶片中的下降程度高于幼嫩叶片。植株中的Cu主要积累在叶片,而叶片细胞中的Cu主要积累于细胞壁。与幼嫩叶片相比,成熟叶片有着显著更高的Cu积累量,其叶绿体显微结构和叶片表面的结构受损程度较高。成熟叶片细胞壁纤维素、半纤维素1与果胶中的Cu含量都显著高于幼嫩叶片中的Cu含量,这与成熟叶片细胞壁纤维素、半纤维素1与果胶有着较高的D-半乳糖醛酸含量相一致,显示细胞壁多糖中羧基与羟基为Cu2+的吸附络合发挥着关键性作用。研究结果还显示,Cu从幼嫩组织向成熟组织的转运要高于从成熟组织向幼嫩组织的转运。本研究还利用双向电泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)和基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-TOF)分析技术分离和鉴定了轮叶黑藻成熟叶片和幼嫩叶片在Cu胁迫下表达差异的蛋白质。结果显示,Cu处理5天后,成熟叶片和幼嫩叶片共有44个蛋白质丰度与对照相比发生≥1.5倍的变化。成熟叶片中有27个蛋白点的丰度上调,4个蛋白点丰度下调。幼嫩叶片中有35个蛋白点的丰度上调,3个蛋白点丰度下调。幼嫩叶片和成熟叶片共同上调的蛋白点丰度有21个,其中有5个点的丰度在成熟叶片中上调比在幼嫩叶片中显著,而有8个点的丰度在幼嫩叶片中比在成熟叶片中上调显著。这些蛋白质涉及细胞壁合成途径的重要酶,如α-1,4葡聚糖蛋白合酶、多铜氧化酶、果胶酯酶、葡萄糖-1-磷酸酯尿甙基转移酶、尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶和尿苷芹菜糖/木糖合成酶。此外,发生差异表达的蛋白质参与了多种生理过程,如光合作用、能量代谢、抗氧化防御、合成代谢、甲基化、转录调控、蛋白质折叠与稳定维持、细胞结构、信号转导等多种代谢途径。特别是参与叶绿体修复(如Rieske铁硫蛋白前体和FtsH蛋白酶)和抗氧化防护(如APX)在幼嫩叶片比在成熟叶片中上调显著。重金属胁迫也会引起植物基因组DNA损伤。本研究利用AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)技术分析了轮叶黑藻叶片基因组DNA损伤水平。结果显示,当Cu浓度增加时,叶片基因组DNA的AFLP多态性程度呈现逐渐增加的趋势,并且在0.1 mg L-1 Cu处理下,成熟叶片的AFLP多态性和8-OHdG含量均显著高于幼嫩叶片。重金属胁迫还会引起植物基因组DNA甲基化异常。轮叶黑藻基因组会发生表观遗传修饰变化以响应 Cu 胁迫。MSAP(Methylation Sensitive Amplification Polymorphism)结果显示,0.1 mg L-1 Cu处理下,成熟叶片基因组DNA的非甲基化5’-CCGG-3’位点百分含量显著增加,总甲基化百分含量显著降低;成熟叶片基因组5’-CCGG-3’位点甲基化与去甲基化变异及幼嫩叶片的去甲基化变异显著增加。本文鉴定出了部分轮叶黑藻基因组DNA甲基化修饰片段,主要包括与甲基化现象和植物生理活动密切相关的基因位点,以及非编码基因的调控序列。以上MSAP检测特异条带序列中存在多种类型的启动子顺式作用元件。此外,结果还显示,轮叶黑藻基因组中CpG二核苷酸富集区域是DNA胞嘧啶甲基化修饰的潜在位点。DNA甲基转移酶活性改变是调控DNA甲基化水平的方式之一。利用蛋白质组学分析技术,发现轮叶黑藻叶片中三种DNA甲基化相关酶类(CMT、DRM和SUVH6-like)的蛋白质丰度在Cu胁迫下显著上调,这可能导致甲基化水平的增加。此外,利用NADPH氧化酶抑制剂预处理实验,发现Cu诱导的ROS(Reactive oxygen species)导致DNA去甲基化模式发生改变,而对甲基化模式的影响较小。Cu处理下,ROS的积累诱发DNA损伤,可能阻止了 DNA甲基转移酶的结合,导致部分位点的去甲基化。本论文的研究结果表明,成熟叶片比幼嫩叶片有着显著更高的Cu积累量,其叶绿体显微结构和叶片表面的结构易受Cu的伤害,Cu从幼嫩组织向成熟组织的转运要高于从成熟组织向幼嫩组织的转运,其原因是成熟组织的细胞壁有较高的D-半乳糖醛酸。利用蛋白质组学技术,发现Cu胁迫下参与叶绿体修复(如Rieske铁硫蛋白前体和FtsH蛋白酶)和抗氧化防护(如APX)的相关蛋白质丰度增加在轮叶黑藻幼嫩叶片中比在成熟叶片中更为显著。Cu胁迫下,DNA甲基转移酶表达改变和ROS积累是基因组DNA甲基化水平发生变化的两种方式。这些研究结果可为阐明水生植物体内铜的毒害机制提供重要的理论依据。