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第一部分应激对人表皮角质形成细胞和黑素细胞RNASET2的表达影响目的：探讨白癜风患者皮损区RNASET2的表达情况；运用改良方法,简单、经济地从人包皮组织中分离扩增得到大量高纯度原代角质形成细胞(HEKs)和黑素细胞(HEMs);在体外观察应激因素作用下HEKs和HEMs中RNASET2的表达情况。方法：利用实时PCR和Western blot分析了白癜风皮损处RNASET2的表达,并用RNASET2的多克隆抗体进行免疫组化研究,以确定白癜风样品中NASET2表达情况；根据原代角质形成细胞和黑素细胞对胰酶的不同耐受性和成纤维细胞不能耐受G418的特性可分离出纯原代黑素细胞和角质细胞；过量的紫外线照射(NB-UVB)、氧化应激(H2O2)、炎症(LPS)刺激体外培养的HEKs和HEMs,利用实时PCR,Western blot和免疫荧光检测技术鉴定HEKs和HEMs在应激作用下RNASET2表达情况。结果：与正常对照组相比较,白癜风患者皮损RNASET2在转录(白癜风vs对照组：4.056±1.115 vs 1.034±0.166；p<0.001)和蛋白水平都显著升高；成功从人包皮组织中分离扩增得到大量高纯度HEKs和HEMs;与未处理组比较,HEKs和HEMs在一定应激作用剂量范围内,RNASET2在转录和蛋白表达水平都有明显升高。结论：白癜风患者皮损处RNASET2显著增加；白癜风诱发因素可以使HEKs和HEMs中RNASET2表达增加。第二部分RNASET2基因产物对原代角质形成细胞和黑素细胞生物学功能的影响目的：探讨体外RNASET2过表达对原代培养的角质形成细胞和黑素细胞的生物学功能影响。方法：利用RNASET2过表达慢病毒分别感染原代角质形成细胞和黑素细胞；感染后72h,用荧光显微镜观察鉴定了慢病毒感染细胞的效率；通过Western blot技术对感染结果进行了鉴定；采用CCK-8细胞活性实验、Annexin V-APC/7-AAD双色标记法和colony-forming法对RNASET2过表达原代角质形成细胞和黑素细胞的增殖凋亡情况进行了研究；通过将适当浓度的外源性氧化应激因素H202加入RNASET2过表达的原代角质形成细胞和黑素细胞中,观察氧化应激对RNASET2过表达细胞的影响；采用实时PCR、Western blot、黑素含量测定以及酪氨酸酶活性测定等技术检测RNASET2过表达对黑素细胞合成黑素能力的影响情况。结果：慢病毒成功感染原代角质形成细胞和黑素细胞72h后,感染效率>90%；与转染空载体(VECTOR)细胞比较,RNASET2过表达(OE RNASET2)引起原代角质形成细胞(VECTOR vs OE RNASET2:4.167±0.330 vs 23.467±1.482; p=0.003)和黑素细胞(VECTOR vs OE RNASET2:5.400±0.455 vs 27.333±1.053; p=0.001)的凋亡具有统计学意义；RNASET2过表达使原代角质形成细胞和黑素细胞对氧化应激更敏感；NASET2过表达导致黑素细胞合成黑素能力下降。结论：RNASET2过表达导致原代角质形成细胞和黑素细胞凋亡；RNASET2过表达导致黑素细胞合成黑素能力下降。第三部分RNASET2基因产物在白癜风发病中的机制研究目的：探讨RNASET2过表达导致原代角质形成细胞和黑素细胞凋亡和黑素合成下降引发白癜风的机制。方法：为探讨RNASET2的促凋亡作用是否依赖于其催化位点,采用RNASET2催化位点突变后的过表达慢病毒(OE RNASET2-ci)分别转染原代角质形成细胞和黑素细胞；同时,由于最近研究发现RNASET2的结构中含有能结合凋亡因子TRAF2的结构域,为证实RNASET2分子中TRAF2结构域是否与RNASET2的促凋亡作用相关,我们将RNASET2的TRAF2结合位点突变后的过表达慢病毒(OE RNASET2-ti)分别转染原代角质形成细胞和黑素细胞；用荧光显微镜观察鉴定了慢病毒感染细胞的效率；通过Western blot技术对感染结果进行了鉴定；采用CCK-8细胞活性实验和Annexin V-APC/7-AAD双色标记法对RNASET2过表达原代角质形成细胞和黑素细胞的增殖凋亡情况进行了研究；为探讨RNASET2的促凋亡作用依赖于RNASET2蛋白与TRAF2蛋白的相互结合作用,采用免疫共沉淀(CO-IP)及Western blot技术检测RNASET2突变前后过表达对细胞凋亡的影响情况。结果：RNASET2催化位点突变后的过表达慢病毒(OE RNASET2-ci)和RNASET2的TRAF2结合位点突变后的过表达慢病毒(OE RNASET2-ti)分别成功感染原代角质形成细胞和黑素细胞,感染效率>90%；RNASET2基因产物导致细胞凋亡不依赖于其催化位点,而是与凋亡因子TRAF2密切相关；RNASET2通过RNASET2-TRAF2-caspases通路引起细胞凋亡。结论：RNASET2基因产物引起细胞凋亡不依赖于其催化位点；RNASET2通过RNASET2-TRAF2-caspases通路引起细胞凋亡。