论文部分内容阅读
研究背景和目的:在各种获得性瓣膜疾病中,最常见的是钙化性主动脉瓣疾病（Calcific aortic valve disease,CAVD）和粘液性二尖瓣退变（Myxomatous mitral valve degeneration,MMVD）。既往文献已经证实,原始瓣膜形成始于心内膜垫,其经历2次内皮-间质转分化过程后瓣叶才发育成熟。从结构上,主动脉瓣瓣叶和二尖瓣瓣叶均可分为三层,各层均由细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）及定植的细胞构成。瓣膜表面由单层的瓣膜内皮细胞（Valve endothelial cells,VECs）覆盖,VECs与瓣叶中间的瓣膜间质细胞（Valve interstitial cells,VICs）共同维持瓣叶稳态。二尖瓣（Mitral valve,MV）及主动脉瓣（Aortic valve,AV）发育来源相似,但拥有完全不同的病理转归,因而我们推测瓣膜结构、生物力学环境和细胞含量的差异可能是导致不同病理表现的原因。VICs作为心脏瓣膜中占比最大的细胞,其在瓣膜病变过程中起到重要调控作用,某种意义上说VICs可能是瓣膜病变的物质基础。在本研究中,我们集中于探索主动脉瓣间质细胞（Aortic valve interstitial cells,AVICs）和二尖瓣间质细胞（Mitral valve interstitial cells,MVICs）差异是否为退行性疾病触发和进展的主要原因。目前关于CAVD的研究较多,而二尖瓣病变研究尚且处于起步阶段。通常认为,主动脉瓣钙化中VICs调控机制可分为成骨细胞转分化以及细胞凋亡导致钙盐被动沉积两方面。既往研究也发现CAVD涉及多个信号转导通路,包括Notch1信号通路、Runt相关转录因子2（Runt related transcription factor 2,Runx2）信号通路、Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路、骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic protein,BMP）/Smad信号通路、以及转化生长因子-β（Transforming growth factorβ,TGF-β）信号通路。此外,氧化应激增加也参与了许多心血管疾病的主要病理过程。研究发现钙化瓣膜组织中凋亡相关蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cysteiny aspartate specific proteinase-3,Caspase-3）活性明显升高,证实细胞凋亡导致的钙盐沉积可能促进瓣膜钙化的进程。基于上述研究背景,本课题将从细胞特征差异、两类VICs成骨转分化潜能差异、氧化应激对两类VICs损伤差异这三方面进行探究,探索其病理转归差异的原因所在。方法:1.通过胶原酶消化法获得猪二尖瓣瓣膜间质细胞（Porcine mitral valve interstitial cells,PMVICs）和猪主动脉瓣膜间质细胞（Porcine aortic valve interstitial cells,PAVICs）;通过组织切片HE染色对猪主动脉瓣瓣膜（Porcine aortic valve,PAV）及猪二尖瓣瓣膜（Porcine mitral valve,PMV）进行组织学检测;通过免疫荧光技术对PAVICs和PMVICs进行表型鉴定;通过流式细胞周期检测对比PAVICs和PMVICs细胞周期的差异性。2.利用OIM培养基诱导VICs构建钙化模型,通过茜素红染色检测VICs内钙盐沉积的变化;通过Western blot检测钙化模型中细胞内Runx2、Sp7、OPN三类钙化相关蛋白的差异表达。3.利用含有不同浓度的H2O2的10%FBS DMEM培养基培养VICs构建细胞氧化应激模型,通过流式凋亡技术检测细胞总凋亡率（早期凋亡率+晚期凋亡率）;通过Western blot检测钙化模型中细胞内Bcl2、Caspase-3两类凋亡相关蛋白差异表达。结果:1.组织切片HE染色结果显示PMV和PAV都是由表面单层的VECs和内部的VICs及细胞外基质组成。显微镜观察显示PAVICs和PMVICs细胞形态均呈长梭样单层生长。2.免疫荧光结果显示胶原酶消化法分离获取的PAVICs和PMVICs均是Vimentin和α-SMA表达阳性,CD31表达阴性。3.流式细胞周期结果显示AVICs和MVICs细胞分布在G0/G1期、G2期差异无统计学意义。与MVICs相比,AVICs的S期细胞占比更多,差异具有统计学意义。4.茜素红染色显示在7天细胞钙化模型中,PAVICs于第5天、第7天可见明显钙盐沉积;PMVICs于第7天可见明显钙盐沉积。Western blot结果显示PMVICs通过钙化诱导后Runx2于第3天达到高峰后开始下降,钙化诱导的第1天、第3天、第5天Runx2表达高于正常组,差异具有统计学意义。而PAVICs中Runx2自钙化诱导第一天明显上升后持续保持高水平,在第5、7天PAVICs中Runx2明显高于PMVICs,差异具有统计学意义。二者OPN均呈先升后降趋势,PAVICs中OPN相比PMVICs更早达到高峰,相同处理组之间差异无统计学意义。二者Sp7均呈先升后降趋势,均在钙化第5天开始含量低于对照组。相比PMVICs,PAVICs中Sp7在钙化第1天和第7天明显更高,差异具有统计学意义。5.流式凋亡检测结果显示H2O2浓度为50μmol/L、100μmol/L、300μmol/L、500μmol/L时,AVICs和MVICs的总凋亡率（早期凋亡率+晚期凋亡率）均略有上升,但和对照组相比,差异均无统计学意义;当H2O2浓度为800μmol/L时,AVICs和MVICs的总凋亡率显著升高,和对照组相比差异均具有统计学意义。当H2O2浓度为0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、300μmol/L、500μmol/L时,AVICs与MVICs总凋亡率相当,差异均无统计学意义;当H2O2浓度为800μmol/L时,AVICs总凋亡率高于MVICs,但差异无统计学意义。6.Western blot结果显示当H2O2浓度为100μmol/L时,MVICs中Bcl2、Caspase-3均达到低谷,与对照组相比差异均具有统计学意义。其余处理组和与对照组相比,差异均无统计学意义。处理组中AVICs的Bcl2、Caspase-3均比对照组有上升,但差异无统计学意义。H2O2浓度相同时,AVICs和MVICs中Caspase-3无明显差异,AVICs的Bcl2比MVICs的Bcl2高,且在H2O2浓度为100μmol/L、300μmol/L时,AVICs中Bcl2表达明显高于MVICs,差异具有统计学意义。结论:1.从组织结构上,PMV和PAV无明显差异。分离的PAVICs与PMVICs在细胞特征方面也无明显差异。2.AVICs在钙化诱导后Runx2可持续高表达可能是AV和MV钙化潜能差异关键所在之一。此外,MVICs体外成骨诱导后期可见钙化相关转录因子表达被抑制,推测MVICs可能存在保护性调控机制,这可能也是AV及MV钙化潜能存在差异的原因。3.凋亡导致的钙盐被动沉积可能不是导致AV和MV病理转归不同的关键因素。