论文部分内容阅读
半纤维素是一类可再生能源物质,其总量占植物干重1/4~1/3,仅次于纤维素,其分解利用对于解决未来能源危机与环境问题意义重大。对半纤维素分解过程中酶促反应的研究以及酶的筛选一直是研究热点。本研究以采集的土壤样品为实验材料,经过富集培养及分离纯化,筛选出两株产β-甘露聚糖酶的菌株。采用摇瓶培养分别测定其酶活力,其中二号株菌株酶活力较高,酶活力达271.85 U/mL,是一号菌株的5.39倍。经生理生化鉴定及16S rDNA序列相似性比较确定一号菌株为假单孢菌(Pseudomonas sp.),二号菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对这两株产酶菌株的最适条件研究发现:假单胞菌以1 g/l00 mL玉米粉,2 g/100 mL魔芋粉,pH6.0,32℃为最优产酶条件,酶活力达185.37 U/mL,是优化前的3.68倍。该菌产酶迅速,培养12 h已达产酶高峰。该酶是一种酸性的β-甘露聚糖酶,作用的最适pH为4.0,最适反应温度为55℃;pH稳定性较好,在pH4.0～6.0较稳定。该酶的作用温度范围较宽,在40℃～55℃酶活力保持稳定。枯草芽孢杆菌以1 g/l00 mL酵母粉,2 g/100 mL魔芋粉,pH6.0,32℃为最优产酶条件,酶活力达1231.41 U/mL,是优化前的4.53倍,已达到同类酶中的较高水平。该枯草芽孢杆菌产酶时间短,发酵培养9 h已达产酶高峰,比其他常见菌株的产酶周期明显缩短。该酶是一种酸性的β-甘露聚糖酶,作用的最适pH为5.0,最适反应温度为35℃;pH稳定性好,稳定范围较宽,在pH4.0～8.0酶活力变化不大;该酶作用的温度范围宽,在35℃～65℃酶活力保持稳定,有很高的工业利用价值。本研究根据已分离的甘露聚糖酶基因特点,结合已发表的枯草杆菌β-甘露聚糖酶基因序列的特点设计特异性引物,成功的扩增出该基因的全长序列。将β-甘露聚糖酶基因man克隆到原核表达载体pET-32a上,得到重组质粒pET-32a-man,然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用1 mM IPTG诱导表达,最佳诱导时间为6 h。经SDS-PGE检测,发现重组菌能正确表达约60 kDa的融合蛋白。用DNS法检测不到重组菌粗酶液酶活性,重组蛋白经可溶性分析表明该蛋白主要以包涵体形式存在。