论文部分内容阅读
猪链球菌(Streptococcus suis, Str. suis)能引起猪脑膜炎、心内膜炎、关节炎、肺炎和败血症等，并能感染人，是一种重要的人畜共患病病原，该菌有35个血清型，其中2型流行最广、且致病性最强。Str. suis能产生多种毒力因子，如溶血素(Suilysin)、溶菌酶释放蛋白(Muramidase-released protein)、胞外因子(Extracellular factor)等，其中的溶血素属于巯基活化细胞毒素家族(Thiol-activated cytolysin, TACY)，能刺激机体产生免疫保护作用，且各型猪链球菌均能产生生化和免疫特性相似的溶血素。因此，以溶血素为免疫原的疫苗有可能对各型猪链球菌感染产生交叉保护作用。沙门氏菌是一种较为常见的侵袭性胞内菌，通过一定方法减毒后对宿主致病性显著降低，但仍保留良好的侵袭力，可携带重组质粒侵入脾和淋巴结等器官组织，并在宿主细胞中表达抗原而诱发特异性的免疫应答反应。以减毒沙门氏菌为载体的疫苗已试用于细菌和病毒性疾病的预防，但目前未见以减毒沙门氏菌为载体进行猪链球菌相关基因表达方面的报道。本试验目的是：1)检验猪链球菌分离株的生物学特性；2)建立以溶血素为靶基因的SUIS PCR检测方法；3)构建溶血素基因的原核和真核表达质粒，并分析表达产物的免疫反应性。 从临床表现为脑膜炎和败血症的发病猪病料中分离到两株链球菌，经生化和血清学鉴定为猪链球菌2型，对小白鼠和家兔均具有一定的致病性。PCR能扩增出猪链球菌MRP、EF和溶血素三个主要毒力因子基因。根据猪链球菌2型溶血素基因序列设计一对引物，成功地建立了检测猪链球菌溶血素基因的PCR方法。用EcoR Ⅰ进行酶切，获得了与预期大小一致的869bp和633bp的两个片段；巢式PCR亦能扩增出预期片段。PCR检测的灵敏程度可达100个细菌，对马链球菌兽疫亚种、类马链球菌、少酸链球菌、猪丹毒杆菌和猪放线杆菌等PCR检测结果均呈阴性。结果表明本试验建立的PCR方法特异性和敏感性均较高，可作为猪链球菌病快速诊断的方法之一。 采用特异性引物PCR扩增猪链球菌2型JX02分离株溶血素基因，将扩增产物克隆到pMD18-T质粒载体中，酶切和PCR鉴定后测序鉴定。结果显示，扩增的JX02株溶血素基因长度为1494bp，编码497个氨基酸，其N末端含有27个氨基酸的信号肚。序列分析表明，猪链球菌JXOZ株溶血素基因及其编码产物属于TACY家族，具有该家族的特征性保守序列ECTGLAWE料R，与猪链球菌2型、1型、4型、8型、19型、昭型和28型等菌株溶血素的氨基酸序列同源性均在99%以上，显示不同血清型猪链球菌产生的溶血素无明显差异。 将溶血素基因克隆入原核表达载体pBV220，重组质粒经鉴定后再导入减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJin株，提取重组质粒进行PCR和酶切鉴定，筛选阳性克隆，用SDS一PAGE电泳和Western blot进行溶血素的表达和鉴定。结果表明，即使在体外无抗生素存在的条件下重组质粒在受体菌ZJ In菌株内比较稳定，能在宿主菌中进行表达，表达产物具有免疫反应性。 PCR扩增猪链球菌JX02株溶血素基因，并将其插入到真核表达载体pcDNA3的CMv启动子下游，构建成真核表达质粒pcDNA3一SLY，将重组质粒导入减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJlll中，并直接转染Vero细胞，细胞形态发生明显变化;提取细胞总DNA，DIG标记探针可检测到阳性杂交信号，SDS一PAGE可检测到58KD的蛋白条带。 本试验结果表明:减毒沙门氏菌可以作为原核和真核表达质粒的载体表达外源抗原，真核表达质粒通过其呈递给Ver。细胞表达猪溶血素，为进一步开展针对溶血素的猪链球菌基因免疫研究奠定了基础。