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转录终止对转录过程具有非常重要的意义,它不仅可以帮助RNA聚合酶从DNA模板上解离,使其参与到下一个转录起始,还可以避免基因通读保证正常RNA的生成。不同物种中转录终止机理差异很大,在原核生物大肠杆菌(E.coli)中存在两种不同类型的转录终止模式:一种依赖于转录终止因子Rho,称为Rho依赖型转录终止;另一种不依靠其他蛋白因子而仅靠自身3UTR区颈环结构,称为非Rho依赖型转录终止或者内在型转录终止。在真核生物中由于存在三种不同类型RNA聚合酶,每一种RNA聚合酶的转录终止模式也存在差异。 叶绿体不仅是光合作用进行的场所,还参与了脂肪酸、维生素、氨基酸等重要化合物的生成。叶绿体基因的表达调控可以保证叶绿体的正常发育及功能维持。转录调控在叶绿体基因表达调控中发挥着重要作用,正常的转录起始可以确保基因在相应发育时期和生长条件下表达,同样叶绿体内基因正常的转录终止对避免基因通读,保证RNA聚合酶再循环从而维持叶绿体功能具有重要意义。尽管在原核生物和真核生物中对转录终止已经开展了大量研究,但植物叶绿体基因转录终止的机制仍不清楚。我们的研究首次揭示了叶绿体内的一种转录终止机理,即RHON1蛋白通过与rbcL3UTR区结合水解ATP提供能量从而终止基因转录。 拟南芥RHON1基因的缺失突变体rhon1-2中,rbcL下游操纵子内基因(包括accD, psaIycf4, cemA,petA)的前体和成熟体含量剧烈升高。Run on检测结果显示,rbcL的转录活性并没有发生变化,但其下游基因的转录活性都明显升高,这可能是rbcL通读后产生超长转录本积累的一种表现。进一步通过5RACE和引物延伸实验检测rbcL和accD的5末端,发现accD出现了非特异的转录起始,这可能是由于rbcL通读产生的干扰。壮观霉素可以通过特异干扰叶绿体基因翻译达到抑制PEP类基因转录的作用,当用壮观霉素处理rhon1-2后accD的转录起始恢复正常。EMSA,RNA免疫共沉淀以及RNase保护实验证明RHON1蛋白可以结合到rbcL基因3UTR区,说明RHON1蛋白可能参与了rbcL基因的转录终止调控。 原核生物中转录终止因子Rho的功能依赖于ATP,我们通过体外对RHON1蛋白分段表达并各自检测其ATPase活性,发现RHON1具有RNA依赖型的ATPase活性。同时RHON1蛋白可以拯救大肠杆菌Rho基因突变菌株HD152对温度敏感的表型,证明RHON1在原核生物体内可以发挥转录终止功能。利用体外转录系统我们发现,RHON1可以在体外终止rbcL基因的转录,但不能终止rrn23-rrn4.5的转录,说明RHON1在体外也可以特异发挥转录终止功能。 单子叶植物中accD基因转移到细胞核中,因此失去rbcL-accD基因结构,通过进一步比对rbcL3UTR区我们发现,单子叶植物中没有RHON1的保守结合碱基序列。同时当我们把RHON1在水稻中的同源基因Os-BP-73转入拟南芥突变体rhon1-2后发现,它不能弥补rbcL基因通读的表型,因此单子叶植物质体中的转录终止机理可能区别于双子叶植物。 综上所述,我们发现RHON1具有终止rbcL基因转录,保证下游基因正常表达的功能。同时从进化的角度来看,RHON1的转录终止功能与其顺式作用元件共同进化且仅存在于双子叶植物中。