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研究背景类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种病因不明,累及周围关节为主,多系统慢性炎症性的自身免疫疾病。RA的发病在我国约为0.4%,在全世界约为0.5%～1.0%。其主要病变发生在关节滑膜,可累及关节软骨、韧带、肌腱及全身组织,引起关节肿痛,继而软骨破坏,关节间隙变窄。如不及早合理治疗,3年内关节破坏率达70%,最终导致关节畸形和运动功能丧失。由于本病较高的发病率和致残率,严重危害人们的生活质量。RA的病因仍未明确。RA的发病和环境、患者的免疫水平、遗传因素、激素水平有很大的关系,同时肥胖人群、糖尿病患者、嗜烟人群的RA发病率也较高。研究发现,在有亲属患RA的人群,其RA发病率较高,为10-30%。在RA的发病中,不同人种中发病率也有一定区别。男性RA发病率为：30-54/100000,女性为13-25/100000。欧洲和北美国家发病率为：0.5%～1%；南美、东南亚国家为：0.2%～0.3%；印第安人群发病率最高,为：5.3%-6.8%。不同人种发病的不同,可能和HLA-DRB1、PADI4、PTPN22、FCRL3等基因的差异有关。因此,RA可能为易感个体被感染因子直接或间接激发所致,而T细胞、B细胞、成纤维样细胞、关节滑膜细胞,以及包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-a, TNF-a)、白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)、IL-6、IL-2、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)、血小板生长因子(platelet growth factor,PGF)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)在内的等多种细胞因子共同参与了RA的关节内与全身的病变过程。RA发病机制尚未完全明确,因而临床上还缺乏特异性治疗措施,其治疗更多是对症治疗,并一定程度上预防和控制关节破坏以及功能的丧失,提高RA患者生活质量。RA的常用治疗方法包括药物治疗、自体造血干细胞移植、基因治疗、免疫净化、晚期的外科手术治疗及其他的辅助治疗。药物治疗包括非甾体抗炎药、慢作用抗风湿药、糖皮质激素、生物制剂等药物。非甾体抗炎药临床应用广泛,可以有效减轻患者的疼痛症状,但长期使用易发生胃肠道症状与肾脏毒性损害,而且由于其抑制前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)的产生,可导致多种炎性细胞因子表达的上升,促进关节内滑膜成纤维样细胞增殖,使远期关节损害更加严重。慢作用抗风湿药包括改善病情的抗风湿药和免疫抑制剂,需长期服药。但这两类药物多有较严重的毒副作用,往往使患者治疗期中不得不停药,难以达到预期的疗效。糖皮质激素可采用全身用药或局部关节注射的方式来治疗RA,长期全身使用糖皮质激素可产生明显的副作用及形成依赖性,使用不当则可能出现机会感染、无菌性骨坏死等严重的并发症,有时这些副作用的危害甚至大于RA病变本身的危害；局部注射可以有效抑制患者关节内炎症反应,减轻其疼痛,但其不能频繁注射,否则会对关节软骨产生一定的破坏作用。生物制剂包括针对细胞黏附分子及受体的生物制剂、针对趋化因子及受体的生物制剂、针对细胞功能的生物制剂、针对细胞因子的生物制剂,常应用于治疗难治性RA。但是目前的生物制剂仅仅是针对某个靶点设计,适用范围较为局限,其长期疗效也有待观察。随着临床应用研究的深入,发现生物制剂的长期使用有可能导致严重的感染或活化隐性结核,而且其价格昂贵,也限制了生物制剂在临床的应用。RA的外科治疗主要包括微创或开放的方式切除病变滑膜和关节置换术。外科手术治疗彻底,效果确切,但具有一定的风险、费用较为昂贵,常应用于其他治疗方法无效的晚期RA。自体造血干细胞移植、基因治疗、免疫净化等治疗方法已经应用于临床,并取得一定效果,但其确切效果有待观察。臭氧(Ozone, O3)是一种新兴的治疗方法,采用03治疗RA可在一定程度上克服上述治疗的不足。03对于关节病变的治疗效果确切,但现有研究多集中在应用03治疗骨性关节炎方面。对于采用03治疗类风湿关节炎方面,临床有小规模的应用,但对03治疗类风湿关节炎的效果无相关系统性研究,对03治疗类风湿关节炎的相关机制也未见报道。这给应用03治疗RA带来了一定的争议,也限制了03在治疗RA方面的应用。在本研究中,我们采用不同浓度(10μg/mL,20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL)03治疗RA大鼠,观察不同浓度03治疗前后RA大鼠大体情况、关节肿胀度,并通过组织切片观察03对RA大鼠的疗效和对RA大鼠滑膜组织的影响,评估不同浓度03对于RA的治疗效果,为临床选用恰当浓度的03治疗RA提供指导。目前人们普遍认为,RA导致的功能障碍、软骨损害、骨侵蚀、畸形,与关节滑膜细胞的凋亡障碍密切相关。凋亡是一种由基因控制的细胞程序性死亡方式,而细胞凋亡障碍被认为是大多数肿瘤和自身免疫性疾病的一个重要病因。因此,要对RA进行有效的治疗,控制滑膜细胞的凋亡是非常关键的。RA的滑膜细胞凋亡过程,和多种信号转导途径有关。在这些信号转导途径中,天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(cysteine-containing aspartate-specific proteases, Caspase)家族起到非常关键的作用。Caspase-3介导细胞凋亡通路主要有三条：细胞内通路、细胞外通路和内质网通路,前两条通路研究较多。在这三条通路中,TNF-a参与细胞外凋亡通路的介导：TNF-a与肿瘤坏死因子受体-Ⅰ(tumour necrosis factor receptor-Ⅰ, TNFRⅠ)结合后,三聚体化的TNFRⅠ通过胞内死亡域,与肿瘤坏死因子受体相关死亡域和胞质中相关死亡域相结合,向下传导凋亡信号,活化上游的caspase-8蛋白,然后激活下游的caspase-3蛋白,引起细胞内DNA的裂解,从而导致细胞凋亡。B-细胞淋巴瘤/白血病-2基因家族蛋白(B cell lymphoma/lewkmia-2, Bcl-2)主要在细胞凋亡的线粒体途径即凋亡的细胞内通路起作用。Bcl-2和B细胞淋巴瘤/白血病-2基因关联x蛋白(B cell lymphoma/lewkmia-2 associated protein x,Bax)分别是Bcl-2家族中最有代表性的抑凋亡和促凋亡分子。在正常生理状态下,细胞内的Bcl-2通过BH3结构域,与同家族的促凋亡分子形成异源二聚体,从而维持促凋亡蛋白在细胞内的定位分布。在细胞凋亡过程中,Bcl-2在凋亡相关因子激活下,易位到细胞内的线粒体膜上,破坏细胞线粒体的完整性,释放线粒体内的促凋亡因子,经过细胞信号转导活化上游的Caspase蛋白,并产生级联反应激活下游的Caspase蛋白,使凋亡信号转到途径逐步放大,最终导致凋亡发生。Bax是Bcl-2活性的主要调控因子,也是Bcl-2家族中研究最广泛的促凋亡蛋白。Bax主要通过与Bcl-2形成异源二聚体来调控细胞的凋亡过程。当细胞内Bcl-2增多时,大量Bcl-2与Bax结合,形成的异源二聚体,减少细胞凋亡的发生；当细胞内Bax含量较多时,Bax除了与Bcl-2形成异源二聚体外,大量的Bax自身形成的同源二聚体,使细胞凋亡现象增强。凋亡信号能激活Bax,使Bax从细胞浆移位到线粒体膜上。Bax在移位到线粒体膜上后,很快形成同源二聚体,促进凋亡,而Bcl-2则在Bax诱发凋亡过程中对其功能进行限制。因此,Bcl-2、Bax的含量及Bcl-2/Bax比值对决定细胞是否进入凋亡状态有重要意义。本课采用不同浓度O3治疗胶原诱导的RA大鼠,观察不同浓度对RA大鼠滑膜炎和滑膜增生的影响,并通过不同浓度03对RA大鼠滑膜凋亡率以及Caspase-3含量和表达的影响,从03影响RA大鼠滑膜细胞凋亡方面解释O3治疗RA的机制；同时观察不同浓度03对RA大鼠滑膜细胞细胞外与细胞内凋亡通路的影响,进一步阐述03对RA的治疗机制。研究目的1.评估O3对于RA大鼠滑膜炎的和滑膜增生影响,为临床选用恰当浓度的03治疗RA提供指导。2.研究不同浓度03对RA大鼠滑膜凋亡率以及Caspase-3含量和表达的影响,探讨03治疗RA的机制。3.研究不同浓度03对RA大鼠血清和滑膜TNF-α、TNFRⅠ、TNFRⅡ的含量的影响,从细胞外凋亡途径阐述03对RA的治疗机制。4.研究不同浓度03对RA大鼠滑膜Bcl-2、Bax表达的影响,从细胞内凋亡途径阐述O3对RA的治疗机制。研究方法1.大鼠RA模型的建立健康雄性Wistar大鼠48只,采用随机数字表法将大鼠随机分为正常对照(CON组,n=6)、类风湿性关节炎组(RA组,n=6)、纯氧注射组(O2组,n=6)和03治疗组(03组,n=30)。03组根据关节腔注射03的不同浓度(μg/mL)分为5个亚组：①03-10组、②03-20组、③03-30组、④03-40组、⑤03-50组,每亚组n=6。取一定量的牛Ⅱ型胶原蛋白溶于O.1M冰醋酸溶液中,配制质量浓度为2 mg/mL溶液,置4℃冰箱中过夜。冰浴下配置浓度为1mg/mL的胶原溶液,抽取1mL于大鼠背部脊柱两侧及尾部皮下分点注射,1周后注射0.5mL加强免疫一次,建立大鼠RA模型。CON组不作任何特殊处理。2.03治疗造模成功后,O2组大鼠注射纯氧1mL,1周注射一次,共注射3周；03组的5个亚组根据分组情况分别注射浓度为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL.50μg/mL的03各1mL,1周注射一次,共注射3周。CON组和RA组不予以任何治疗。3.取材治疗结束后1周,戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下,戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下,用75%酒精消毒大鼠后肢和尾部,沿膝关节正中纵行切开皮肤,暴露膝关节,完整剥离滑膜组织。所有动物在O2组和03组大鼠在最后一次关节腔注射1周后处死,进行关节滑膜的取材,4%多聚甲醛固定过夜。同时,断尾取血,离心机离心,取上清液。4.不同浓度03对大鼠关节肿胀情况的影响从造模开始至动物处死,每周记录1次。5.不同浓度03对大鼠足爪厚度的影响用电子游标卡尺测量小鼠双足后肢足掌厚度,从造模开始每周测量一次,直至处死。分别测量3次,取平均值。6.不同浓度03对RA大鼠关节滑膜切片的影响取大鼠关节滑膜标本,常规方法脱水、透明、浸蜡包埋成石蜡块,应用石蜡切片机,制成4μm的石蜡切片。HE染色观察滑膜组织增生、炎性细胞浸润、结缔组织增生、血管翳产生的情况。不同浓度03对大鼠关节肿胀情况的影响7.不同浓度03对RA大鼠关节滑膜凋亡指数的影响取膝关节滑膜组织石蜡切片,行转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling, Tunel)法染色后,沿滑膜组织带计算×400视野中细胞的凋亡数,计数5个视野,记录每个视野平均凋亡数,取其平均值。正常滑膜细胞为蓝紫色,凋亡滑膜细胞为棕色。细胞凋亡指数(apoptotic index, AI)计算方法：AI=(凋亡细胞数÷滑膜细胞总数)×100%。8. Caspase-3分光光度法检测取滑膜上清液,采用分光光度计于λ=405nm测定其吸光值。通过计算OD来确定Caspase-3含量。9. Caspase-3的West-blotting检测滑膜取材后,抽提滑膜蛋白,上样10μg加入到20μl2×十二羟硫酸钠凝胶加样缓冲液中,沸水中煮沸8分钟使蛋白变性,10000rpm离心5分钟。上样后以电压100伏转膜1小时,10%脱脂奶粉的封闭液中封闭2小时。加入一抗(1：500)、二抗(1：1000)各反应1小时,后续工作按ECL发光试剂盒说明书完成。采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(37 kD)做为内参。10.大鼠血清与滑膜TNF-α、TNFRⅠ、TNFRⅡ含量的检测取滑膜上清液与血浆,行血清TNF-α、TNFRⅠ、TNFRⅡ含量的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。11.不同浓度03对类风湿性关节炎大鼠Bcl-2、Bax表达的影响大鼠滑膜组织切片于60℃恒温箱烘烤60min进行烘片,二甲苯脱蜡,乙醇梯度水化,3%H202-甲醇溶液灭活酶,分别加入100ul一抗(Bcl-2和Bax稀释度均为1：100)和荧光标记二抗,封片,荧光显微镜观察拍照。每个关节观察2张切片,阳性细胞计数取两张切片的均值。每张切片观察×400下5个视野。12.数据统计分析所得数据用SPSS13.0软件行统计学处理,对大鼠足爪厚度的比较采用General Linear Model中的repeated measures进行分析,检验水准为α=0.05,P≤0.05表示差异有统计学意义或有显著性差异。其余测量数据均采用Compare Means中的one-wayanova进行分析,检验水准为α=0.05,P≤0.05表示差异有统计学意义或有显著性差异。研究结果1.不同浓度03对大鼠关节肿胀情况的影响造模7d后,大鼠出现滑膜炎症状,双足各个关节及足垫出现红肿,造模14d关节红肿明显。造模后21d大鼠关节肿胀达到高峰。RA组、02组、03-10组、03-20组大鼠28d后关节肿胀逐渐减轻,处死前仍存在关节红肿现象。第一次、第二次03注射后一周,03-30组、03-40组大鼠红肿现象均较前次显著减轻。第三次03注射后一周,03-30组、03-40组大鼠已无红肿现象。第一次03注射后一周,03-50组大鼠红肿现象较注射前更为显著。第二次03注射后一周及处死前,03-50组大鼠红肿现象红肿仍较明显,但较第一次有所减轻。2.不同浓度03对大鼠足爪厚度的影响实验前各组大鼠之间足爪厚度无显著差异(P>0.05)。除CON组大鼠外,各组大鼠足爪厚度7d开始逐渐增高,造模后21d关节厚度最大。与造模后21d相比,造模后28d 03-30组、03-40组大鼠足爪厚度减小(P<0.01),两组组间比较差异无统计学意义。造模后35d,RA组、02组03-10组、03-20组、03-40组、03-50组大鼠足爪厚度较CON组增大,差异有统计学意义(P<0.01),O3-30组与CON组及RA组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。造模后42d,03-40组大鼠足爪厚度较造模后35d减小,差异有统计学意义(P<0.05)。与CON组相比,RA组、02组、03-10组、03-20组、03-30组大鼠足爪厚度增大,差异有统计学意义(P<0.05)。03-50组大鼠足爪厚度较CON组增大,差异有统计学意义(P<0.01)。3.不同浓度03对RA大鼠关节滑膜切片的影响CON组：关节结构正常,滑膜组织无充血水肿,滑膜细胞无增生现象,无血管翳形成；RA组、02组：可见明显的滑膜细胞和结缔组织增生,排列紊乱,炎性细胞浸润明显,滑膜组织内有血管翳形成；03-10组、03-20组：滑膜细胞增生略有减轻,滑膜组织充血水肿减轻,血管增生和浸润炎细胞数量减少,血管翳形成减少；03-30组、03-40组：滑膜细胞增生不明显,滑膜组织充血水肿明显减轻,血管增生和浸润炎细胞数量减少,血管翳形成显著减少；03-50组：滑膜组织较CON组减少,排列紊乱,结缔组织增生,炎细胞浸润明显。4.不同浓度03对RA大鼠关节滑膜凋亡指数的影响CON组滑膜存在散在凋亡。与CON组相比,RA组、02组的正常和凋亡滑膜细胞增多,凋亡率下降,差异有统计学意义(p<0.05)。与模型组相比,各03治疗组凋亡率上升。其中,03-10组、03-20组滑膜细胞凋亡率与RA组相比较,差异无统计学意义(P>0.05)；03-30组、03-40组、03-50组滑膜细胞凋亡率与RA组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。5.不同浓度03对RA大鼠关节滑膜Caspase-3含量的影响与CON组相比较,RA组、02组03-10组大鼠滑膜中Caspase-3含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)；三组组间相比,差异无统计学意义(P>0.05)。与CON组相比较,03-30组、03-40组Caspase-3含量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。二组组间相比,03-40组Caspase-3含量高于03-30组,差异有统计学意义(P<0.05)。03-20组、03-50组大鼠滑膜中Caspase-3含量与CON组相比较,差异无统计学意义(P>0.05)。6.不同浓度03对RA大鼠关节滑膜Caspase-3蛋白表达的影响与CON组相比较,RA组、02组、03-10组03-50组大鼠滑膜Caspase-3蛋白表达下降,差异具有显著统计学意义(P<0.01)；与CON组相比较,03-20组大鼠滑膜Caspase-3蛋白表达下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。与CON组相比,03-30组大鼠滑膜Caspase-3蛋白表达升高,差异无统计学意义(P>0.05)。与CON组相比较,03-40组大鼠滑膜Caspase-3蛋白表达升高,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。7.不同浓度03对RA大鼠关节滑膜Bcl-2、Bax表达的影响各组大鼠滑膜组织均可见Bcl-2和Bax阳性表达细胞,其中CON组表达最弱,RA组表达最强。与CON组相比较,RA组、02组、03-10组大鼠滑膜中Bcl-2阳性细胞数增多,Bax阳性细胞数减少,差异有统计学意义(P<0.01)；三组组间相比,差异无统计学意义(P>0.05)。与RA组相比较,03-20组、03-50大鼠滑膜中Bcl-2阳性细胞数减少,Bax阳性细胞数增多,差异有统计学意义(P<0.05)；两组组间相比,差异无统计学意义(P>0.05)。与RA组相比较,03-30组、03-40组大鼠滑膜内Bcl-2阳性细胞数减少,Bax阳性细胞数增多,差异有统计学意义(P<0.01)。二组组间相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.采用关节内注射浓度为40μg/mL的03治疗RA,可以明显减轻滑膜的炎性细胞的浸润,减少结缔组织和血管翳的形成,缓解关节肿胀,具有较好的治疗效果。2.03治疗RA的机制与其增加RA大鼠滑膜细胞凋亡,上调Caspase-3蛋白表达有关。3.03可以降低滑膜内TNF-α、TNFRⅡ的活性,上调TNFRⅠ的表达,以关节内注射浓度为40μg/mL的03作用较为明显。4.03治疗后RA大鼠滑膜内Bcl-2表达下降,Bax表达上升是其主要治疗机制。