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本论文以脱硫菌Rhodococcus sp.LY822为出发菌株,开展了硫酸盐对LY822菌脱硫代谢的影响、脱硫基因克隆表达及重组菌脱硫活性的研究,初步阐明了脱硫代谢机理,验证了脱硫酶生成的"硫饥饿"诱导机制.
1.研究了不同浓度的Na2SO<,4>对Rhodococcus sp.LY822细胞生长和脱硫的影响.Na2SO<,4>在0-0.4 mmol/L浓度范围内对LY822菌的生长没有影响,但对其生长细胞脱硫活性具有抑制作用;在有DBT和0.03 mmol/L以上的:Na2SO<,4>存在时,LY822菌生长细胞的粗酶液在脱硫反应48h内没有2-HBP生成,而Na2SO<,4>在0.01:mmol/L以下时,其脱硫反应能生成2-HBP;.Na2SO<,4>对含有脱硫酶的无细胞粗提液的脱硫活性无抑制作用.研究表明,0.03 mmol/L以上浓度的Na2SO<,4>能阻遏脱硫酶的生成,而0.01 mmol/L以下浓度能诱导脱硫酶生成,从而验证了脱硫微生物脱硫酶生成的"硫饥饿"诱导机制.
2.克隆了LY822菌脱硫基因的启动子,构建了dsz启动子-gfp报告基因表达载体pBSG,并转化原始菌(LY822),激光共聚焦显微镜和荧光分光光度计检测结果显示,无Na2SO<,4>时菌体的荧光强度为存在0.1 mmol/L:Na25O<,4>时的3倍,证实了脱硫基因的表达受硫酸盐的阻遏;WesternBlotting结果显示,0.2 mmol/L:DBT存在时下培养的LY822菌的全细胞蛋白有与DszA,DszB和DszC杂交的特异性条带生成,而0.2 mmol/L,Na2SO<,4>存在时则无特异性条带产生,进一步证明了脱硫酶的生成受到硫酸盐的阻遏;以LY822菌的总RNA为模板进行RT-PCR,0.2 mmol/L DBT存在时培养的LY822菌,可扩增得到与脱硫基因dszA,dszB和dszC大小相对应的cDNA片段;而0.2 mmol/L:Na2SO<,4>存在时培养的LY822菌,未扩增到特异性条带,表明硫酸盐对LY822菌脱硫基因表达的调控作用发生在转录水平上.
3.克隆了LY822菌的脱硫基因dszA,dszB和ldszC,并在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达,与Rhodococcus erythropolis IGTS8相关基因的相似性分别为99.9﹪、100﹪和99.5﹪,证实了红球菌脱硫基因的高度保守性;3种重组大肠杆菌的无细胞粗酶液脱硫反应的代谢产物与已报道的"4S途径"中的相应代谢产物一致,证明LY822菌对DBT的降解符合专一性脱硫的"4S途径";重组大肠杆菌无细胞粗提液表现出比原始菌(LX822)更高的脱硫活性.
4.构建了dszC基因的表达载体pBSC,转化至消除质粒的原始菌(LY822-0)和不具备脱硫特性的紫红红球菌(ACCC NO.10494)中,所获重组菌均具有脱硫反应活性,并不受硫酸盐影响.研究结果为构建不受硫酸盐阻遏的高效脱硫基因工程菌奠定了基础.