论文部分内容阅读
鸭瘟(Duck Plague,DP),又名鸭病毒性肠炎(DuckViral Enteritis,DVE),由Bau-det 1923年首次报道,我国于1959年首次报道。该病是鸭、鹅和天鹅的一种急性败血性传染病,其特征为体温升高、两腿麻痹、下痢、流泪和部分病鸭头颈肿大,为一种泛嗜性感染的传染病;临床以急性败血症过程为特征:血管损伤,体腔出血,消化道出血,炎症和坏死,淋巴器官受损以及实质器官的退行性变化。鸭瘟的发病率和死亡率非常高,是养鸭业的一大危害。鸭瘟的病原是鸭瘟病毒(DEV),DEV属于疱疹病毒属,但尚未明确定其所属的亚科。目前,已测明鸭瘟病毒的部分基因,其中有gH基因。gH基因编码鸭瘟病毒的囊膜蛋白。疱疹病毒的囊膜蛋白参与病毒与细胞的融合、病毒在细胞间的扩散、病毒从细胞核释放的细胞浆过程等。
本研究根据GenBank上发表的DEV gH基因的核酸序列设计了两对引物:其中一对在gH基因的两端引入限制性内切酶Bgl Ⅱ的识别位点序列;另外一对用于改变gH基因上的Pme Ⅰ限制性内切酶位点。提取鸭瘟弱毒疫苗株的DNA后进行PCR反应,扩增出2505bp、并改变了酶切位点的gH完整的ORF。将其克隆入pGEM-T easy,筛选出重组质粒Pgem-T-gHmu。利用限制性内切酶Bgl Ⅱ酶切pGEM-T easy与腺病毒穿梭载体质粒pAd-CMV5-IRES-GFP,将gH基因插入腺病毒穿梭载体质粒中,获得重组穿梭质粒pAd-gH-IRES-GFP。重组穿梭载体线性化后,将其电转化至BJ5183感受态细胞进行同源重组,获得重组腺病毒质粒rAd-gH-IRES-GFP。用限制性内切酶Pac Ⅰ线性化重组腺病毒质粒rAd-gH-IRES-GFP后,转染AD-293细胞。转染十天后,成功包装出重组腺病毒rAd-gH-IRES-GFP,并利用PCR进行验证。
重组腺病毒rAd-gH-IRES-GFP在AD-293细胞上连续传10代,对第5、10代病毒进行PCR检测、Western-blotting检测和TCID50测定。结果表明外源基因能在重组腺病毒rAd-gH-IRES-GFP中稳定遗传,并能得到表达。第5、10代重组腺病毒rAd-gH-IRES-GFP的TCID50分别为10-8.6/mL、10-8.9/mL。
重组腺病毒rAd-gH-IRES-GFP对Balb/c小鼠的免疫试验结果表明,在二免两周后抗体达到最高水平,在二免后五周抗体仍然维持较高水平。重组腺病毒rAd-gH-IRES-GFP对白鸭的免疫试验表明,二免后一周抗体水平达到最高水平,然后迅速降低,到二免后第26天降到最低。攻毒保护试验表明:重组腺病毒rAd-gH-IRES-GFP可以缓解鸭瘟的发生,具有一定的保护力。