【摘 要】
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第一部分:恶臭假单孢菌中聚3-羟基脂肪酸解聚酶的基因克隆、表达及酶活测定;聚3-羟基脂肪酸(Poly-3-hydeoxyalkanoates)简称PHA,因其具有的可生物降解性而成为被广泛关注的新
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第一部分:恶臭假单孢菌中聚3-羟基脂肪酸解聚酶的基因克隆、表达及酶活测定;聚3-羟基脂肪酸(Poly-3-hydeoxyalkanoates)简称PHA,因其具有的可生物降解性而成为被广泛关注的新型聚合材料之一,在包装、制药、医学上得到了广泛的应用.PHA在自然界中能够被许多细菌和其它生物体所表达的PHA解聚酶降解,对PHA解聚酶的研究在PHA的工业利用中占有重要的地位.该文研究了恶臭假单孢菌中PHA解聚酶基因(phaZ)的结构和表达产物的性质.作者采取PCR法从恶臭假单孢菌中克隆得到了PHA解聚酶基因,序列分析显示其共有853个碱基,编码283个氨基酸的蛋白产物,表达产物分子量为31.3 KDa,与报道的PHA解聚酶基因有较高的同源性.将PHA解聚酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中高水平表达,并将形成的包涵体应用一步稀释法复性,从而研究了重组PHA解聚酶的生化特性,结果表明其最适温度为40℃,反应最适pH为8.0.这是首次从恶臭假单孢菌中克隆PHA解聚酶基因,并在大肠杆菌中进行异源表达,这些研究显示出了较高的理论价值和广泛的应用前景.第二部分:铜绿假单孢菌中GL-7ACA酰化酶的基因克隆与表达;戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶(GL-7ACA)酰化酶可以将GL-7ACA转化为7-aminocephlosporanic acid(7-ACA),在两步酶法生产7-ACA上有着广泛的应用.该研究采取PCR法从铜绿假单孢菌中克隆得到了GL-7aca酰化酶基因(galA),共有2544个碱基,其编码的蛋白产物有848个氨基酸残基,分子量为94.1 Kda.PCR反应在gal A基因的转录起始位点引入了Nde I位点,便于galA基因直接插入到表达质粒核糖体结合位点之后进行表达.随后研究了假单孢菌galA基因在大肠杆菌中与链霉菌中的表达.将galA基因置于大肠杆菌启动子T7下,构建表达质粒pET-gal,在相应的大肠杆菌BL21(DE3)中表达,但是没有得到明显的蛋白表达条带,也没有检测出GL-7ACA酰化酶的活性,有可能是大肠杆菌中的蛋白酶系统降解了表达产物.
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