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目的：
本研究采用微生物技术、蛋白质技术和免疫学技术等技术手段纯化黄姑鱼IgM,制备兔抗鱼IgM多克隆抗体,建立黄姑鱼抗体检测技术,研究分析受免黄姑鱼的抗体产生规律,同时,研究黄姑鱼对副溶血弧菌灭活疫苗的免疫应答能力。为黄姑鱼细菌性疾病的人工免疫防治提供理论依据,为黄姑鱼人工免疫的疫苗接种途径和加强免疫时间等提供数据支撑。
方法：
1.采用饱和硫酸铵沉淀法和葡聚糖凝胶SephadexG-200凝胶柱层析,分离和纯化黄姑鱼免疫球蛋白,然后采用SDS-PAGE分析纯化蛋白的部分特性,将其作为免疫原再免疫接种新西兰大白兔制备兔抗黄姑鱼IgM多克隆抗体。
2.建立间接ELISA测定黄姑鱼抗体水平的技术方法,确定抗原包被浓度和检测血清最佳工作浓度,二抗和酶标三抗最适稀释倍数,抗原包被条件的选择,底物的最佳反应时间等间接ELISA的实验条件。
3.通过注射和浸泡两种不同免疫方式接种黄姑鱼后,应用间接ELISA法对黄姑鱼血清中抗体水平进行检测,分析抗体在黄姑鱼体内的产生规律。
结果：
1.通过硫酸铵沉淀法和SephadexG-200凝胶柱层析方法分离,获得纯度较高的免疫球蛋白,经β-巯基乙醇处理后解离形成重链和轻链两个亚单位,分子量分别为72.4 kD、28.8 kD,表明黄姑鱼血清IgM的分子量与硬骨鱼IgM的分子量范围(H链60 kD-81kD,L链20 kD.30kD)是一致。然后以纯化后的黄姑鱼IgM作为免疫原接种新西兰兔制备兔抗黄姑鱼:IgM多克隆抗体。
2.建立了间接ELISA测定黄姑鱼抗体的方法,试验的最佳反应条件为:抗原最适工作浓度浓度为1×10 cfu/mL,包被4℃过夜；检测血清稀释度分别为1:80；自制兔抗黄姑鱼IgG作1:80稀释；购买的羊抗兔IgG-HRP酶标抗体作1:3000稀释；选择底物的最佳反应时间为15min。
3.研究得出了黄姑鱼接种副溶血弧菌灭活疫苗后抗体的产生规律。注射免疫接种不同浓度副溶血弧菌灭活疫苗后,黄姑鱼抗体水平从第7 d开始逐步升高,在免疫后28d达到峰值,随后逐渐下降；浸泡免疫组则在第21 d达到峰值,随后逐渐下降。
4.注射和浸泡低浓度疫苗的黄姑鱼产生的抗体水平都要低于高浓度组的黄姑鱼抗体水平；免疫后相同时间条件下,注射组抗体水平高于浸泡组水平。注射免疫三组中灭活疫苗浓度为1×108cfu/ml免疫效果较好,显著高于其它各组。
结论：
1、成功纯化出黄姑鱼血清IgM,重链和轻链的分子量分别为72.4 kD、28.8 kD；
2、制备了兔抗黄姑鱼IgM多克隆抗体。
3、建立了黄姑鱼抗体间接ELISA检测技术,间接ELISA测定黄姑鱼抗体的方法,最佳反应条件为:抗原最适工作浓度浓度为1×108cfu/mL,包被4℃过夜；检测血清稀释度分别为1:80；自制兔抗黄姑鱼IgG作1:80稀释；购买的羊抗兔IgG-HRP酶标抗体作1:3000稀释；选择底物的最佳反应时间为15min。
4、注射免疫接种不同浓度副溶血弧菌灭活疫苗后,黄姑鱼抗体水平均在免疫后28 d达到峰值,随后逐渐下降,证实注射免疫接种副溶血弧菌在首次接种后28 d左右需要进行加强免疫；浸泡免疫的加强免疫时间为首次免疫后21 d。