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目的:本研究旨在利用分子生物学和细胞生物学方法研究14-3-3β基因对BCBL-1(KSHV positive and EBV negative human B cells)细胞迁移、凋亡以及细胞周期的影响,探讨14-3-3β基因在卡波氏肉瘤(Kaposis Sarcoma,KS)发生发展中的作用以及14-3-3β基因在KS发病中可能的机制。
方法:通过脂质体转染法,将14-3-3β真核表达载体转染入BCBL-1细胞,利用G418筛选试剂筛选细胞4~5周,从而获得14-3-3β真核表达载体稳定转染的BCBL-1细胞株。转染72小时后通过Western-blot鉴定含外源性基因14-3-3β的细胞,证实基因转染是否成功,并观察细胞的形态结构;筛选4周后再通过Western-Blot鉴定外源性基因14-3-3β的表达,证实外源基因是否依然存在。利用Transwell细胞迁移分析方法分析14-3-3β基因对BCBL-1细胞迁移的影响;利用碘化丙啶(PI)染色试剂盒,通过流式细胞仪检测分析转染14-3-3β基因后细胞周期时相比,利用生物学规律公式计算细胞增殖指数(proliferation index,PI);利用Annexin V-FITC Apoptosis Deteaion kit试剂盒,通过流式细胞仪检测分析转染14-3-3β基因后细胞的凋亡率(apoptosis rate,AR)。
结果:(1)转染72小时与筛选4周后,通过Western-Blot均检测到外源性基因14-3-3β的表达。(2)Transwell细胞迁移分析方法分析细胞迁移,分析结果显示:迁移6小时时重组体转染组、空载体转染组及未转染组细胞迁移数分别为35.75±8.07、20.13±5.25、19.38±5.26,迁移8小时时重组体转染组、空载体转染组及未转染组细胞迁移数分别为52.63±10.62、32.25±5.80、32.38±6.35,6小时与8小时时重组体转染组细胞迁移数与空载体转染组及未转染组比较,均有显著性差异(P<0.05)。(3)细胞周期检测分析结果显示重组体转染组细胞的S%=2.03±0.39、G2%=1.12±0.33,与空载体转染组及未转染组比较,均有显著性差异(p<0.05)。重组体转染组、空载体转染组及未转染组增殖指数分别为3.16±0.59%、1.10±0.39%、1.09±0.36%,重组体转染组与空载体转染组及未转染组比较,均有显著性差异(p<0.05)。(4)细胞凋亡率检测分析结果显示重组体转染组、空载体转染组及朱转染组BCBL-1细胞的凋亡率分别为0.90±0.059%、3.01±0.158%、2.99±0.33%,重组体转染组与空载体转染组及未转染组比较,均有显著性差异(p<0.05)。
结论:(1)14-3-3β基因能够促进BCBL-1细胞迁移和增殖;(2)4-3-3β基因能抑制BCB1-1细胞凋亡;(3)14-3-3β基因与KS细胞迁移、增殖、凋亡相关。