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水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）是一种全球性普遍存在的对神经系统具有高度趋向性的人类疱疹病毒，主要引发两种不同临床表现的疾病:初次感染可引发水痘（varicella or chickenpox），长期潜伏再激活后可引发带状疱疹（herpeszoster or shingles）。水痘是一种具有高度传染性的儿童常见皮肤疾病，带状疱疹则多发于中老年人以及免疫妥协或缺陷的病人，并随着年龄增大而发病率显著增加，具有严重的危害性。目前仍缺乏水痘和带状疱疹的特效治疗药物，接种疫苗是预防水痘和带状疱疹的最经济有效的措施。vOka株是目前使用的水痘/带状疱疹减毒活疫苗株，但研究已显示，vOka株虽然可在人皮肤中减毒，但仍具有感染和潜伏人神经系统的能力，其安全隐患不容忽视。因此，开发新型的更为安全有效的水痘-带状疱疹疫苗已成为当前的迫切需求。在前期研究中，我们与合作实验室应用反向遗传学技术首次发现VZV体外复制的非必需基因orf7是VZV体内感染人皮肤和背根神经节组织的双嗜性决定因子，同时ORF7敲除的VZV毒株可在人T细胞和树突状细胞中扩增。这提示了ORF7表达缺失VZV毒株具有发展为新型水痘-带状疱疹减毒活疫苗候选株的潜力。本研究即在此基础上，探索构建ORF7缺失的新型VZV候选疫苗株，并开展病毒学、毒力和免疫原性等研究，分析其发展为新型水痘-带状疱疹疫苗的可行性，同时进一步对ORF7的功能以及ORF7表达缺失的减毒机制进行探索，为VZV的防治方法研究提供基础。 本研究首先应用反向遗传学方法构建了不包含报告基因等非病毒株来源基因序列的新型ORF7表达缺陷减毒株V-7D，通过PCR鉴定、基因测序、蛋白印迹法检测等方法验证构建的V-7D的ORF7抗原表达缺陷，符合预期设计。MRC-5细胞是一种人胚肺成纤维二倍体细胞，已被较广泛应用于包括现有水痘疫苗在内的多种人用疫苗的制备。本研究评价了V-7D在MRC-5细胞中的培养特性。结果显示，V-7D可以在MRC-5细胞中高效复制，其效价与vOka株相当。本研究进一步应用透射电镜对V-7D与原型毒株pOka感染后的MRC-5细胞进行观测。结果显示，V-7D与pOka在感染MRC-5细胞中的病毒颗粒数量、分布及超微结构均无明显差别。同时，本研究应用蔗糖密度梯度离心与蛋白印迹法分别分析了V-7D、vOka与pOka在感染后MRC-5细胞的裂解上清（疫苗主要成分）中的主要病毒抗原的差异。结果显示，除V-7D组不能检测到ORF7抗原外，V-7D、vOka与pOka组在其它包括病毒糖蛋白、衣壳蛋白以及典型皮层蛋白在内的主要病毒抗原的含量与分布均未见明显差异。上述结果说明，本研究成功构建了ORF7表达缺陷的新型VZV候选疫苗株V-7D，其可在人二倍体细胞株MRC-5中高效增殖;ORF7的表达缺陷并不会显著影响VZV在MRC-5细胞中的组装，以及细胞裂解上清病毒主要抗原的含量与分布。 为验证V-7D对人类VZV易感组织的感染能力，本研究构建了人胸腺、皮肤、背根神经节移植的SCID-hu人鼠嵌合模型，并应用上述模型开展相关实验。通过将不同毒株分别感染人皮肤、背根神经节移植的嵌合模型小鼠，在感染后不同时间点应用PCR、免疫组织化学等方法进行检测。结果显示，本研究构建ORF7表达缺陷的V-7D株无法有效感染人皮肤和背根神经节组织，而原型对照毒株pOka则可高效感染人皮肤和背根神经节组织。为更好地验证ORF7缺陷对VZV毒力的影响，本研究首次在SCID-hu人鼠嵌合模型中模拟了VZV天然感染的过程。结果显示，VZV-7D与对照VZV-ROka株均可以经树突状细胞感染人胸腺组织T细胞;随后分离出感染后的人胸腺T细胞并静脉接种人皮肤嵌合模型小鼠，其中VZV-ROka可通过T细胞介导成功感染人皮肤组织，而VZV-7D无法通过感染T细胞的介导再感染嵌合模型小鼠的人皮肤组织。上述结果说明，ORF7表达缺失的VZV毒株具有发展成为新型水痘或带状疱疹疫苗所必需的安全性特征。 本研究进一步对V-7D的免疫原性进行研究。应用与vOka株相同的方法制备V-7D疫苗原液，再将V-7D与vOka以相同剂量分别对大鼠和豚鼠进行免疫，评价其激活体液与细胞免疫反应的水平。在体液免疫反应方面，应用gpELISA和膜抗原荧光抗体实验方法检测结果显示，V-7D和vOka免疫后动物血清中的VZV抗体滴度均显著升高，二者激活体液免疫反应的水平相当。在细胞免疫反应方面，V-7D和vOka免疫后大鼠的脾细胞经相应病毒刺激分泌的IFN-γ水平与阴性对照组相比均显著提高，其反应水平亦基本相当。同时，本研究应用SCID-hu人鼠嵌合模型研究了V-7D与VZV-pOka接种人皮肤和胸腺组织后激活固有免疫反应的情况。结果显示，V-7D和pOka接种人皮肤后都能在短时间内显著提高组织促炎症细胞因子的分泌水平，其中pOka因为能够感染其激活的固有免疫反应持续时间长，V-7D则因为无法感染其激活的固有免疫反应会逐渐恢复到阴性水平;另一方面，人T细胞对V-7D和pOka感染的固有免疫反应较低，甚至出现固有免疫能力下降的趋势。上述结果说明，V-7D具有与vOka株相当的免疫原性，可有效激活机体的体液免疫、细胞免疫以及固有免疫反应，具有发展为新型疫苗的良好潜力。 本研究进一步对ORF7的功能和作用机制进行探索，主要包括ORF7蛋白性质鉴定、ORF7相关蛋白-蛋白相互作用和ORF7功能域分析研究。(1)在ORF7的蛋白性质方面，本研究首次通过实验证据证明了ORF7属于VZV皮层蛋白，并且ORF7包装进入病毒颗粒皮层依赖于其高尔基体定位，而ORF7的高尔基体定位又依赖于ORF7 N端保守的第9位保守半胱氨酸以及VZV未知功能蛋白的调控。另外，本研究还鉴定出ORF7属于磷酸化蛋白，其中（病毒感染或细胞转染）真核表达的ORF7具有丝氨酸和酪氨酸的磷酸化修饰，而原核表达ORF7仅具有酪氨酸磷酸化修饰;在体外激酶实验中，原核表达ORF7能够被病毒蛋白激酶ORF47丝氨酸磷酸化，因此ORF7属于ORF47激酶底物。本研究通过软件预测获得多个ORF7潜在磷酸化位点，其中ORF7 N端20-23 aa的“SYEE”序列中包含了ORF47底物磷酸化的共有序列及保守的酪氨酸位点。通过对该序列的点突变分析发现，ORF7第20位丝氨酸突变不影响其整体丝氨酸磷酸化水平，但是ORF7第21位保守酪氨酸突变后其酪氨酸磷酸化水平明显减弱。(2)在ORF7相关蛋白-蛋白相互作用研究方面，本研究制备了针对VZV25种主要结构蛋白的多抗血清或单克隆抗体，并与前期研究获得的VZV抗体组成可用于检测VZV33种重要抗原的抗体库。接着，本研究应用免疫共沉淀的方法从VZV-ROka感染的ARPE-19细胞中筛选出与ORF7相互作用的10种病毒蛋白，应用试剂盒从7390种人源性蛋白库中筛选出与ORF7相互作用的66种宿主细胞蛋白。随后，本研究应用293T细胞转染的真核表达实验，确认了ORF7与ORF47和GRASP65存在直接相互作用，但与ORF9没有直接相互作用。最后，本研究在VZV-ROka和VZV-7D感染的ARPE-19细胞中观察到与ORF7相互作用的4种VZV蛋白的亚细胞定位及其与细胞骨架相互作用在ORF7敲除后出现异常。(3)在ORF7功能域分析方面，本研究确定了ORF7 N端序列存在影响VZV体外与体内毒力的关键功能域，而ORF7至少66 aa到C端的全部氨基酸序列对VZV的毒力无任何影响。另一方面，突变ORF7 N端高尔基体定位信号后虽影响了ORF7在病毒皮层内的包装以及VZV在体外细胞上的毒力，但是却不影响病毒在体内人皮肤和DRG组织中的毒力，该结果提示了ORF7 N端存在影响VZV毒力的不同功能域。 综上所述，本研究获得了具有良好成苗性、安全性和免疫原性特征的新型减毒疫苗株V-7D，探讨了ORF7表达缺失在人皮肤和神经组织中减毒的可能机制，为继续深入阐释ORF7在VZV感染和致病过程中的功能提供线索，为新型疫苗株V-7D的进一步研发提供重要的理论和技术支持。