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1.研究背景与目的急性肺损伤／急性呼吸窘迫综合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome,ALI/ARDS)是临床较为常见的危重症,由心源性以外的各种肺内、外致病因素导致的急性、进行性呼吸衰竭。其主要病理特征为由于肺微血管通透性增高,肺泡渗出富含蛋白质的液体,进而导致肺水肿及透明膜形成,可伴有肺间质纤维化。病理生理改变以肺容积减少、肺顺应性降低和严重通气／血流比例失调为主。临床表现为呼吸窘迫和顽固性低氧血症,肺部影像学表现为非均一性的渗出性病变。尽管采取强有力的重症监护措施,死亡率仍达30-50%。近年来的研究表明存在肺水形成和吸收动态平衡机制：ALI/ARDS肺水形成是由于肺血管通透性增加,导至水肿液形成并积聚在肺间质和肺泡腔。肺水吸收主要依靠存在于肺泡Ⅰ型(ATⅠ)和Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)的钠水转运系统,主要由上皮钠通道(ENaC)、环核甘酸门控的阳离子通道(CNG)、水通道(AQP)和Na+-K+-ATP酶等组成。肺泡腔内液体的吸收,一般先是水肿液中的Na+通过肺泡上皮细胞顶膜的ENaC、CNG进入细胞内,再经上皮细胞基底外侧的Na+-K+-ATP酶进入肺间质。肺泡腔内的液体则由Na+转运后造成的渗透压梯度驱动,或通过AQP进入肺间质而后吸收入血液循环。肺泡上皮液体重吸收与渗出平衡,就能建立一个稳定的状态,为ALI/ARDS的恢复争取时间。Ware等的临床研究显示大多数肺泡上皮液体转运功能受到损伤的通透性肺水肿和肺损伤病人,有着更长的呼吸衰竭期和更高的死亡率；相反,少数肺泡水肿液较快清除的病人有着更高的生存率。临床证据表明,ALI/ARDS状态下肺水清除明显下降,主要是由于肺泡上皮液体转运功能受到损伤引起的,但具体机制还有待阐明。ALI/ARDS时肺组织细胞出现凋亡和坏死,可以破坏一部分钠水转运系统,在未发生凋亡和坏死细胞上的钠水转运系统状态又是如何呢?在我们前期的研究中发现,ATⅡ在ARDS状态下钠转运功能明显下降。最近Johnson、Borok等相继在ATⅠ上也发现存在ENaC和Na+-K+-ATP酶,并且ATⅠ钠转运能力是ATⅡ的2.5～3倍。根据以上事实可以推测,钠水转运系统的破坏和功能下降在ARDS肺水肿发生中可能起重要作用。在我们前期的研究中观察到,油酸致ARDS大鼠血管外肺水显著增加,予以特布他林(Terbutaline, cAMP激动剂)后血管外肺水明显减少。ARDS大鼠ATⅡ全细胞电流较正常组显著下降,但仍可观察到全细胞电流,该电流大部分可被ENaC阻滞剂Amiloride抑制,并且在Terbutaline刺激下全细胞电流明显增加,不仅超过正常组全细胞电流水平并可达到正常组Terbutaline刺激下的全细胞电流水平。Lucky Jain等发现,当ATⅡ生长于玻璃平板并浸没于不含类固醇激素的培养液时,ATⅡ上所表达的钠通道绝大部分是单位电导约21-pS,钠、钾选择性接近于1的非选择性阳离子通道(NSC)；而当ATⅡ生长于可渗透性支持物,基底膜浸于培养基,顶膜暴露于空气中,并且培养基中含有类固醇激素时,ATⅡ上表达的绝大部分是低电导的6.6±3.4pS,高度钠选择性的通道(HSC), PNa/PK>80,并可被低于微摩尔级浓度的Amiloride阻断。Xi-Juan Chen等发现Terbutaline对两类通道的作用机制也不同：对于NSC, Terbutaline增加NSC开放概率但不改变NSC数目；对于HSC, Terbutaline增加HSC数目但不改变开放概率。Johnson等在急性分离ATⅡ上证实了这两种通道的存在,因此,在ALI/ARDS状态下Terbutaline可能不仅增加HSC的数量,还增加NSC的开放概率来增加ENaC的电流。然而,Norlin等发现AFC还受非Amiloride敏感的环核甘酸门控通道(CNG)的影响。1-cis-Diltiazem(CNG抑制剂)在大鼠正常对照组对肺水清除率(AFC)无影响,提示CNG似乎不参与AFC；然而在Terbutaline组1-cis-Diltiazem却抑制AFC达50%,与Amiloride作用相当。Kemp等在大鼠ATⅡ进一步研究了该通道,显示该通道为cGMP调控的、非Amiloride敏感的、非选择性的阳离子通道(Na+／K+通透比率为0.73±0.02)。因此,在Terbutaline刺激下,可能还通过增加经CNG的Na+流,从而增加AFC。在ALI/ARDS状态下情况更为复杂。我们前期的研究发现油酸致ARDS大鼠ATⅡcAMP降低、cGMP升高,血管外肺水增加；应用Terbutaline后cAMP升高,cGMP与油酸组比无明显变化,血管外肺水明显减少。这是否意味着(1)在ALI/ARDS状态下CNG的Na+流是增加的,应用Terbutaline后该Na+流并未进一步增加,Terbutaline减少ARDS状态下血管外肺水并不通过增强CNG功能这条途径?或(2)在ALI/ARDS状态下CNG内吞,细胞膜上CNG数量减少,即使cGMP增加,也不能明显影响该通道；Terbutaline可以通过增加CNG向膜上转运从而增加细胞膜上CNG数量来增加CNG通道电流?本研究拟采用膜片钳技术,研究ENaC和CNG在ALI/ARDS状态下Na+转运中的作用机制,从而进一步完善对ALI/ARDS病理生理机制的认识。2.研究方法选用健康雄性SPF级Sprague-Dawley大鼠,体质量180-220g。采用油酸0.1 ml/kg股静脉注射制备ALI/ARDS模型,血气分析结合病理切片进行模型评价。肺泡腔内胰酶灌注消化法分离ATⅡ,台盼蓝染色法鉴定细胞活力,碱性磷酸酶染色法鉴定ATⅡ。在膜片钳全细胞膜式下,应用amiloride(ENaC阻断剂)和ZnCl2(CNG阻断剂)观察正常和ALI/ARDS状态下ATⅡ上ENaC和CNG通道电流的变化以及特布他林作用下两者的反应,从而了解ENaC和CNG的钠离子转运功能。细胞刺激程序为：钳制电压0 mV,予以-100 mV持续500ms的电刺激并记录基础电流后,更换含amiloride 10μM浴液5分钟后记录amiloride抑制后电流,最后更换含amiloride 10μM, ZnCl2 1mM浴液5分钟后记录amiloride和ZnCl2联合抑制后电流。采用SPSS13.0软件进行统计学处理。3.研究结果3.1 ALI/ARDS模型大鼠股静脉注射油酸后,2min内出现呼吸急促,多数在30min后有叹气样呼吸,胸腹矛盾运动,气管插管内有红色分泌物,大鼠口唇部发绀。油酸肺损伤后PH值由损伤前7.36±0.01降至7.24±0.02(P<0.05)；PaO2由12.44±0.23kpa降至6.05±0.45kpa (P<0.05); PaO2/FiO2由445.28±8.39降至216.61±16.16(P<0.05)；PaCO2由5.45±0.15 kpa升至7.22±0.59(P<0.05)。开胸可见肺充血、肿胀,以双下肺为重,边缘圆钝,胸膜紧张发亮,气道内有泡沫状血性分泌物。病理切片显示支气管周围可见袖套样水肿,肺泡等组织形态欠清晰,肺泡腔内红染,可见红细胞,肺泡间质明显增宽、水肿,粒细胞显著增多,局灶性肺不张,坏死。3.2 ATⅡ的分离和鉴定ATⅡ经AKP染色被染成蓝紫色。正常组细胞活力(91.00±2.10)%,纯度(57.33±5.05)%；油酸肺损伤组细胞活力(83.50±1.64)%,纯度(51.00±4.34)%,细胞活力和纯度均比比正常组下降(P<0.05)3.3离子通道电流ATⅡ全细胞电流可被amiloride和；ZnCl2抑制(P<0.01),显示存在amiloride敏感电流和Zn2+敏感电流；amiloride敏感电流占(39.42±12.36)%,Zn2+敏感电流占(29.70±8.14)%,两者所占比例无差别(P>0.05)。特布他林可增加amiloride敏感电流(主效应F=26.963,P<0.001)和Zn2+敏感电流(主效应F=40.786,P<0.001)；amiloride敏感电流占(50.87±8.08)%,Zn2+敏感电流占(30.17±7.62)%, amiloride敏感电流所占比例约为Zn2+敏感电流的1.7倍(P<0.05)油酸肺损伤时ATⅡ全细胞电流仍可被amiloride和ZnCl2抑制(P<0.01),显示仍存在amiloride敏感电流和Zn2+敏感电流,但两者均较正常时下降(主效应F=25.997,P<0.001；主效应F=17.870,P<0.001),予以特布他林后,两者均可恢复到正常水平(主效应F=26.963,P<0.001；主效应F=40.786,P<0.001)。4.结论(1)肺泡腔内胰酶消化法可以获得一定纯度的ATⅡ,应用AKP染色鉴定ATⅡ,适用与肺泡巨噬细胞区别。能用光镜观察,操作简便,染色步骤少,30分钟内可获得结果,与其它方法比较,非常简便有效。(2)急性分离的ATⅡ上具有功能性ENaC和CNG,并且两者在Na+转运中起主要作用,但ENaC起更主要的作用；特布他林作用下ENaC和CNGNa+转运均增强,ENaC仍起更主要的作用。(3)结合Norlin等的结果可以推论：正常大鼠ATⅠ上Na+转运以ENaC和CNG为主,但ENaC起更主要的作用；特布他林作用下ENaC和CNGNa+转运均增强,但CNG起更主要作用。(4)大鼠油酸肺损伤模型是比较好的ALI/ARDS模型。经股静脉注射油酸,与尾静脉注射相比,注射难度小,剂量准确；与下腔静脉注射相比,克服了不必要的创伤。油酸用量在0.1 ml/kg,模型成型快,复制成功率高,大鼠出现的症状、体征、血气和病理改变与ALI/ARDS相符。(5)油酸肺损伤大鼠ATⅡ活力和纯度均下降,ATⅡ上ENaC和CNG仍具有Na+转运功能,但其Na+转运功能明显减弱；在特布他林作用下两者明显增强,并可达到正常水平。