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研究背景： 糖尿病(diabctes mellitus，DM)和心血管疾病是全球目前最主要的疾病负担和死亡原因，国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation，IDF)在2013年推测全球糖尿病在20-79岁成人中的患病率为8.3％，估计到2035年全球将有近5.92亿人患糖尿病。中国大陆地区有1亿人患糖尿病，中国已成为世界上糖尿病患者最多的国家。动脉粥样硬化是糖尿病患者的主要死亡原因，糖尿病患者的心脏病疾病相关的死亡率是非糖尿病患者的2～4倍，而绝大多数急性心血管事件都与血栓形成有关，在该过程中血小板的激活是启动因素，其激活途径具有多样性，其中GPⅡb/Ⅲa受体激活是血小板活化聚集的最终共同途径，与血小板聚集、血栓形成密切相关。糖尿病状态下血栓形成机制尚未完全阐明，其中血小板活化和血管内皮细胞损伤可能起着关键作用。 抗血小板治疗能显著降低糖尿病患者的心脑血管事件发生率，然而即使在双重抗血小板治疗下，糖尿病患者的血小板聚集和活化仍然增加，因此寻找最佳抗血小板治疗方案对于降低糖尿病患者的心血管疾病风险，降低死亡率具有重要意义。近期的研究结果强调了蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)、微粒（microparticle，MP）在血小板活化过程中的作用。PDI可以通过调控血小板表面GPⅡb/Ⅲa受体二硫键的异构，促使GPⅡb/Ⅲa受体空间结构改变，活化GPⅡb/Ⅲa受体，进而活化血小板，促进血栓形成。糖尿病状态下，血管内皮细胞受损，释放更多的内皮细胞源的微粒(endothelial derived microparticles，EMP)，血小板活化增多，而且血小板也释放更多血小板源微粒(platelet derived microparticles，PMP)，其上携带PDI。 我们推测糖尿病状态下，内皮细胞受损，释放出EMP，其上携带PDI，EMP-PDI通过与血小板表面的GPⅡb/Ⅲa受体结合，活化血小板，释放更多的携带PDI的PMP，从而实现了血小板级联放大信号的传导;同时血小板源性PDI削弱了胰岛素的抗血小板活化的作用。因此，糖尿病患者血小板的粘附聚集能力显著增加，容易形成血栓。 研究目的： (1)研究糖尿病状态下血浆中血小板活性和PDI含量的变化; (2)研究糖尿病状态下血浆中凝血状态的变化; (3)探讨糖尿病导致的内皮细胞受损EMP、EMP-PDI释放量的变化; (4)从整体水平探讨糖尿病状态下EMP-PDI在血小板活化过程中的作用。 研究方法及材料： (1)动物模型建立 4周龄雄性ApoE-/-小鼠60只，行腹腔注射糖耐量试验(intraperitoneal glucosetolerance test，IPGTT)后随机分为普通饮食组（30只）和高糖高脂饮食组（30只），分别给予普通饮食和高糖高脂饮食，6周后再次测各组小鼠的IPGTT。出现胰岛素抵抗的高糖高脂饮食组的小鼠腹腔注射注射链脲佐菌素(streptozocin，STZ)85mg/kg-90mg/kg，2周后随机血糖≥11.1 mmol/L时，可作为ApoE-/-小鼠2型糖尿病成模的动物入组。再将小鼠分为普食组，普食+芦丁组，糖尿病组，糖尿病十芦丁组各15只小鼠，普食组和糖尿病组小鼠每日予生理盐水灌胃一次，剂量为0.1ml/10g;普食+芦丁组，糖尿病十芦丁组小鼠每日予芦丁灌胃一次，剂量为80mg/kg，灌胃8周后取小鼠的血液用于实验。 (2)小鼠体重的监测:每周定期监测小鼠的体重。 (3)血浆的获得 取小鼠心尖血于0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝的EP管中。常温下，3000rpm/min离心后获得乏血小板血浆(platelet-poor plasma，PPP)，用于后面的实验。 (4)血小板的提取 常温下，取小鼠心尖血于0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝的EP管中，经过800rpm/min离心10分钟后获得富含血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)，后者经800g/min离心，离心10分钟后获得血小板沉淀。血小板沉淀经改良台式液洗涤、重悬。血小板悬液的浓度经细胞计数仪调整为1×106/ml，用于后面的实验。 (5)流式细胞术检测小鼠血小板活化指标 流式测血小板表面P-selectin(CD62P)、GPⅡb/Ⅲa及血小板白细胞聚集体(platelet-leukocyte-aggregetes，PLA)的表达:在BD流式管中加入适量待测样品及待检测指标相应的荧光抗体，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)补齐至100μL，室温避光孵育15-30min，然后加200μL4％多聚甲醛混匀固定后上机检测。 (6)酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 小鼠血浆中PDI、可溶性P-选择素(soluble P-selectin，sP-sel)、血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)、纤维蛋白原(fibrinogen，Fib)的含量。所有的操作方法及步骤严格按照说明书的要求进行。 (7)原位-邻位链接技术（proximity ligation assay，PLA）证实EMP-PDI可以与血小板上的GPⅡb/Ⅲa结合 原位-邻位链接技术是一种新的生物检测技术，可用于检测两种蛋白质间的相互作用，当两种蛋白发生反应时，两种蛋白上的荧光探针也可以相互结合，从而可检测到红色的免疫荧光，如果两种蛋白没有发生相互作用，则检测不到红光。分离得到血小板和EMP后按照实验步骤进行，经过抗体孵育、PLA探针孵育、链接、扩增、封片后在荧光显微镜下进行观察。 结果： (1)ApoE-/-小鼠糖耐量试验结果 IPGTT结果显示:4周时普通饮食组小鼠与糖尿病组小鼠的IPGTT结果的差异无统计学意义(P＞0.05);小鼠分别经普通饮食和高糖高脂饮食喂养6周后，普通饮食组小鼠经普通饮食喂养前后IPGTT结果差异无统计学意义（P＞0.05）;糖尿病组小鼠经高糖高脂喂养前后IPGTT结果差异具有统计学意义(P＜0.05)，同时10周龄时糖尿病组小鼠糖耐量结果较普通饮食组小鼠显著升高（P＜0.05）。 (2)ApoE-/-小鼠体重变化情况 4周龄时，各组ApoE-/-小鼠体重差异没有统计学意义(P＞0.05);高糖高脂饮食喂养4周后，与普通饮食组小鼠相比，糖尿病组ApoE-/-小鼠体重增加，差异具有统计学意义(P＜0.05);注射STZ2周后，糖尿病组小鼠与普通饮食组小鼠体重差异无统计学意义(P＞0.05);继续分别经高糖高脂饮食和普通饮食喂养至20周龄时，糖尿病组小鼠体重明显大于普通饮食组（P＜0.05）。 (3)ApoE-/-小鼠血生化结果 与糖尿病组小鼠相比，普食组、普食+芦丁组、糖尿病+芦丁组小鼠总胆固醇(totalcholesterol，TC)，甘油三酯(triglyceride，TG)低密度脂蛋白胆固醇(low densitylipoprotein cholesterol，LDL-C)水平均明显降低(P＜0.05～0.001)。四组小鼠血浆中高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）的含量差异无统计学意义(P＞0.05)。 (4)各组小鼠血浆中Fib含量无显著差异，糖尿病组小鼠血浆vWF含量增加 ELISA检测小鼠血浆中Fib的含量，结果显示四组小鼠间Fib的含量差异无统计学意义(P＞0.05）。ELISA检测小鼠血浆中vWF的含量，结果显示糖尿病组小鼠vWF的含量较普食组、普食+芦丁组和糖尿病+芦丁组血浆中vWF的含量均升高，差异具有统计学意义（P＜0.05～0.01），普食组，普食+芦丁组和糖尿病+芦丁组间vWF的含量差异无统计学意义(P＞0.05）。 (5)糖尿病小鼠血小板活化增加 流式细胞术检测小鼠血小板活化水平，糖尿病组小鼠血小板表面的GPⅡb/Ⅲa、P-selectin的表达量升高，差异具有统计学意义(P＜0.05～0.001)，普食+芦丁组的GPⅡb/Ⅲa表达量低于普食组的表达量，差异具有统计学意义(P＜0.05)，糖尿病+芦丁组的GPⅡb/Ⅲa、P-selectin表达量低于糖尿病组，差异具有统计学意义(P＜0.01～0.001)。测血小板白细胞聚集体(PLA)的结果显示糖尿病组小鼠的血小板单核细胞聚集体(platelet-monocyte aggregates，PMA)、血小板中性粒细胞聚集体(platelet-neutrophil aggregates，PNA)的表达量均高于普食+芦丁组和糖尿病+芦丁组小鼠的表达量，差异具有统计学意义(P＜0.05～0.001)，普食+芦丁组小鼠的表达量的PMA、PNA的表达量均低于普食组小鼠的表达量，差异具有统计学意义(P＜0.05～0.01)。 (6)糖尿病小鼠血浆中sP-sel含量增加 ELISA检测小鼠血浆中sP-sel的含量，结果显示糖尿病组小鼠sP-sel的含量较普食组，普食+芦丁组和糖尿病+芦丁组小鼠sP-sel的含量升高，差异具有统计学意义(P＜0.05～0.001);普食组，普食+芦丁组和糖尿病+芦丁组间小鼠sP-sel的含量差异无统计学意义。 (7)糖尿病组小鼠血浆中CD144+的EMP含量增加，EMP上携带有PDI，糖尿病组EMP-PDI的含量增加。 流式细胞术检测小鼠血浆中CD144+EMP的含量，结果显示糖尿病组小鼠CD144+的EMP的含量较普食组，普食+芦丁组和糖尿病+芦丁组的含量升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，普食组，普食+芦丁组和糖尿病+芦丁组间含量差异无统计学意义(P＞0.05)。以CD144-APC和PDI-FITC双色流式细胞术证实EMP上携带PDI，糖尿病组小鼠EMP-PDI的含量较普食组，普食+芦丁组和糖尿病+芦丁组含量升高，差异具有统计学意义(P＜0.05～0.01)。 (8)糖尿病小鼠PDI含量增加 ELISA检测小鼠PDI含量，结果显示糖尿病组的PDI含量高于普食组，普食+芦丁组和糖尿病+芦丁组的含量，差异具有统计学意义(P＜0.05～0.001)，同时，普食+芦丁组低于普食组、糖尿病组和糖尿病+芦丁组的含量，差异具有统计学意义(P＜0.05～0.001)。 (9)内皮细胞来源的微粒的分离及鉴定 以CD144标记为内皮细胞来源的微粒，经免疫磁珠分选技术及超速离心后，使CD144+的EMP的阳性率由50％左右升高到90％。分离得到的微粒经流式细胞仪采用100nm和1000nm标准荧光微球圈出微粒的门。透射电镜观察分离得到的微粒，为典型的直径大于100nm的双层膜小囊泡。 (10)EMP可以活化血小板，RL90及芦丁抑制EMP介导的PDI依赖的血小板活化 我们分别用二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)（10μg/mL）、RL90（1μg/mL）、芦丁(60μM)预处理EMP，然后分别去刺激C57正常小鼠的血小板，检测血小板的活化水平。结果显示四组小来源的微粒在不同的刺激条件下，EMP刺激血小板后的血小板的GPⅡb/Ⅲa、P-selectin的表达量高于对照组、RL90(1μtg/mL)、芦丁（60μM）预处理的EMP刺激血小板后血小板的GPⅡb/Ⅲa、P-selectin的表达量，差异具有统计学意义(P＜0.05～0.001)。 (11)糖尿病小鼠来源的EMP活化血小板活化增加 通过对普食组、普食+芦丁组，糖尿病组和糖尿病+芦丁组小鼠来源的EMP在相同刺激条件下的GPⅡb/Ⅲa的表达的比较，发现ADP孵育EMP刺激组糖尿病组小鼠的GPⅡb/Ⅲa的表达较普食组降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。在其他相同刺激条件下，糖尿病组来源的EMP刺激后的血小板GPⅡb/Ⅲa、P-selectin的表达量增加，差异具有统计学意义(P＜0.05～0.001)。 (12) Duolink原位-邻位链接技术（proximity ligation assay，PLA）证实EMP-PDI可以与血小板上的GPⅡb/Ⅲa结合 分离得到血小板和EMP后按照实验步骤进行，经过抗体孵育、PLA探针孵育、链接、扩增、封片后在免疫荧光显微镜下进行观察。我们检测到血小板上的红光，证实EMP-PDI与血小板上的GPⅡb/Ⅲa发生结合。 结论： (1)糖尿病小鼠血小板表面GPⅡb/Ⅲa、P-selectin表达量显著增加，血浆PNA增加，血小板活化增加; (2)糖尿病小鼠血浆中血脂增高，sP-sel、vWF含量均增加，血液处于高凝状态; (3)糖尿病小鼠血浆中EMP、PDI、EMP-PDI含量升高，内皮功能受损; (4)内皮损伤后可以释放更多EMP，EMP与血小板表面的GPⅡb/Ⅲa相结合，激活血小板，糖尿病状态此过程增强; (5)PDI通过活化GPⅡb/Ⅲa参与了EMP介导的血小板活化，此过程可以被芦丁部分抑制，糖尿病状态下此作用增强。