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背景与目的结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率在我国有逐年上升趋势。化疗是结肠癌的重要治疗手段之一。然而,耐药形成是化疗失败并导致肿瘤复发和患者死亡的主要原因之一。多药耐药机制涉及药物代谢酶和ABC转运蛋白,但其详细作用机制尚不清楚。孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)又名类固醇和外源性受体(steroid and xenobiotic receptor,SXR),属核受体家族重要成员之一,在保护机体免于内源性和外源性物质损伤方面有重要作用。PXR可广泛调节药物代谢及药物转运。与相应配体结合后被活化,与RXRα以异二聚体形式结合于靶基因的调控区域。PXR调控的靶基因包括:几种细胞色素氧化酶如CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19和CYP2B6、脱氢酶、羧酸脂酶等;药物II相代谢还原酶如UDP-葡萄糖苷酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferases,UGTs)和谷光苷肽S转移酶(Glutathione S-transferases,GSTs)等;(3)药物III相转运体如MDR1、多药耐药相关蛋白家族、有机离子转运肽2等。这些靶基因都涉及肿瘤多药耐药形成。PXR可能通过对其靶基因调控,介导药物之间相互作用及个体对药物的反应差异,改变肿瘤细胞内药物代谢和转运,影响肿瘤患者化疗敏感性。由上可知,PXR涉及MDR机制众多位点,这可能更符合体内多药耐药形成实质及肿瘤患者个体化治疗需要。因此,PXR可能成为肿瘤治疗和多药耐药研究的潜在靶点。过表达ABC转运体是肿瘤多药耐药的主要原因之一。MRP3是多药耐药相关蛋白家族(MRP,ABCC亚家族)的主要成员之一,属ATP膜转运蛋白,在氨基酸序列上与MRP1有58%同源性,编码分子量为190kD的糖蛋白,表达于极性细胞基底侧,主要分布于肝、十二指肠、结肠、肾上腺及胰腺等。MRP3作为一种有机阴离子转运体,能转运胆汁酸盐、葡萄糖醛酸苷结合物以及某些化疗药物。有研究发现MRP3与白血病预后不良有关。在肿瘤细胞中MRP3与铂类药物耐药相关。两个MRP3多态性位点已被鉴定可影响非小细胞肺癌患者铂类药物敏感性。MRP3基因多态性与结肠癌危险之间的关系已被研究,提示MRP3与结肠癌化疗的遗传药理学有潜在的关联。这些研究表明MRP3在肿瘤耐药中的重要作用,也提示MRP3在以铂类药物为基础的结肠癌化疗中的可能作用。MRP3表达调控机制目前尚不清楚。分析MRP3启动子区5’-端发现TATA盒较少,含多个SP1、AP-1、AP-2和LRH-1的结合位点。大鼠近侧Mrp3启动子区SP1和LRH-1结合位点是Mrp3转录活性所必需的。最近有研究发现核受体涉及MRP3的转录调控,包括PPARα、VDR和RARα。PXR是否涉及其中尚无定论,但有研究发现PXR配体可诱导MRP3表达。本课题拟通过检测包括PXR在内的代谢性核受体及耐药相关基因在结肠癌组织中表达情况,初步探讨PXR和其他代谢性核受体在结肠癌中意义,并进一步分析结肠癌组织中核受体PXR与耐药相关基因的联系。通过活化或敲低PXR表达,研究其对结肠癌细胞增殖和化疗敏感性影响,探讨PXR调控MRP3表达及可能机制在结肠癌耐药中的作用。方法1.收集结肠癌组织标本,采用RT-PCR和Western blot法,检测结肠癌组织中核受体及耐药相关基因表达情况。半定量分析PXR、MRP2和MRP3 mRNA表达,用配对样本t检验比较癌与正常组织之间的差异,Pearson相关性检验分析PXR与MRP2、MRP3之间的关系。2. RT-PCR和Western blot法检测结肠癌细胞系核受体PXR表达情况,及10μM利福平处理LS174T细胞后PXR表达变化。MTT法观察利福平作用后对LS174T细胞增殖及对化疗药物敏感性的影响。3.选用两条针对PXR基因不同靶点的RNAi序列及随机对照序列,构建真核表达质粒PXRi 1#、PXRi 2#以及阴性对照质粒PXRi control,转染结肠癌LS174T细胞,用G418稳定筛选出相应细胞克隆。RT-PCR和Westernblot法检测野生型LS174T细胞、PXRi control、PXRi 1#和PXRi 2#细胞PXR和MRP3表达情况,MTT法检测PXR敲低后对结肠癌细胞增殖和化疗敏感性的影响。4. RT-PCR和Western blot法检测LS174T细胞经10μM利福平或5μM紫杉醇作用后SP1、PXR和MRP3表达变化。5.免疫荧光方法检测5μM紫杉醇处理LS174T细胞后膜蛋白MRP3和PXR表达变化及细胞定位。6.用PXR表达质粒、MRP3报告基因、pRL-SV40质粒共转染LOVO细胞,分为四组:转染Control组(共转染相应空质粒)、DMSO组(共转染PXR表达质粒+0.1%DMSO)、RIF组(共转染PXR表达质粒+10μM RIF)和paclitaxel组(共转染PXR表达质粒+5μM paclitaxel),然后用双荧光素酶报告基因方法检测MRP3报告基因萤火虫荧光活性,以pRL-SV40质粒海肾荧光活性为内参照。结果1.在结肠癌组织中,RARα、PXR、MRP2和MRP3 mRNA表达和蛋白表达明显上调,VDR和PPARαmRNA表达也明显上调,但FXR、LRH-1、SP1、ABCG2、MDR1和CYP3A4 mRNA表达变化不明显。2.半定量分析显示:在17例结肠癌组织和相应正常结肠组织中,PXR、MRP2和MRP3 mRNA相对表达水平分别为:0.679±0.262 vs 0.389±0.271(PXR,P=0.000);0.703±0.459 vs 0.351±0.234(MRP2,P=0.000);0.668±0.203 vs 0.441±0.193(MRP3,P=0.000)。与正常结肠组织相比,结肠癌组织中PXR、MRP2和MRP3 mRNA相对表达水平升高约2倍左右,其中以MRP2 mRNA相对表达水平升高最为明显,且升高具均有统计学意义。相关性检验示:结肠癌组织、正常组织以及癌组织/正常组织中,MRP3 mRNA相对表达水平与PXR均呈显著的正相关性(P=0.001;P=0.000;P=0.007),而MRP2 mRNA相对表达水平与PXR均无显著的相关性(P=0.842;P=0.342;P=0.443)。3.在结肠癌细胞株LS174T、LOVO、HT29和HCT116中,LS174T细胞高表达PXR,低表达或不表达LRH-1;在利福平作用不同时相点,MRP3 mRNA表达随PXR mRNA表达变化;经10μM利福平或5μM紫杉醇处理后,LS174T细胞中PXR、SP1和MRP3表达明显增强。4.在10μM利福平作用下,LS174T细胞增殖速度明显加快,第3天、第5天、第7天的490nm波长处吸光度值(OD)分别为:0.682±0.048、1.183±0.156、1.817±0.095;而0.1%DMSO处理对照组相应的OD值分别为:0.528±0.035、0.920±0.036、1.402±0.092。利福平组OD值均明显高于相应DMSO组,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。利福平处理后,可降低细胞对化疗药物敏感性。利福平组奥沙利铂IC50值从DMSO组的(8.80±0.26 )μg/ml升高至(19.37±4.22)μg/ml,且升高具有统计学意义(P=0.012)。而相似地,利福平组5-氟尿嘧啶IC50也从DMSO组(32.27±2.92)μg/ml升高至(62.3±9.08)μg/ml,升高也具有统计学意义(P=0.005)。5.用RNAi技术特异性沉默LS174T细胞PXR基因表达,与野生型LS174T细胞和PXRi control细胞相比,PXRi 1#和PXRi 2#细胞中mRNA和蛋白表达均明显受到抑制,而相应地MRP3表达也减弱。6. PXR敲低后,细胞增殖明显受到抑制,野生型LS174T细胞和PXRi control细胞第3天、第5天、第7天的OD值分别为:0.496±0.029、1.150±0.056、1.57±0.036和0.540±0.016、1.123±0.050、1.54±0.064,两组值差异均不明显,且均不具有统计学意义(P>0.05);PXRi 1#和PXRi 2#细胞第3天、第5天、第7天OD值分别为:0.313±0.019、0.640±0.040、0.782±0.073和0.284±0.009、0.680±0.026、0.835±0.059,均明显低于相应PXRi control组,且均具有统计学意义(P<0.05)。PXR敲低后,可提高细胞对化疗药物的敏感性。在20μg/ml奥沙利铂作用下,野生型LS174T细胞和PXRi control细胞存活率分别为:(36.8±5.4)%,(37.9±6.9)%;PXRi 1#和PXRi 2#细胞存活率分别下降至:(8.0±1.1)%,(11.4±2.2)%,与PXRi control组相比,且均具有统计学意义(P=0.000;P=0.000)。在5μg/ml 5-氟尿嘧啶作用下,野生型LS174T细胞和PXRi control细胞存活率分别为:(78.9±5.3)%,(80.5±5.6)%;PXRi 1#和PXRi 2#细胞存活率分别下降至:(57.6±7.0)%,(62.3±6.7)%,与PXRi control组相比,且均具有统计学意义(P=0.008;P=0.029)。7.激光共聚焦显微镜显示:5μM紫杉醇可增强LS174T细胞PXR表达,且向核浓聚,细胞膜MRP3表达也增强。表明紫杉醇活化PXR后可上调LS174T细胞MRP3表达。8. DMSO组报告基因相对荧光活性是转染Control组的两倍多,但差异不具有统计学意义((4.67±0.60)×10-2 vs (2.23±0.31)×10-2, P=0.095)。共转染处理组分别经10μM Rif和5μM Paclitaxel处理24h后,其相对荧光活性均明显增强:利福平组为(7.93±0.91)×10-2,与DMSO组相比,升高具有统计学意义(P=0.025);紫杉醇组为(12.30±1.85)×10-2,与DMSO组相比,升高更明显,差异具有统计学意义(P=0.000)。结论1.核受体PXR、MRP2和MRP3在结肠癌组织中差异上调,提示其与结肠癌耐药相关;2.结肠癌及相应正常组织中,MRP3与核受体PXR mRNA表达呈正相关;3.核受体PXR配体利福平活化PXR,可促进结肠癌细胞增殖,降低结肠癌细胞化疗敏感性;4. RNAi技术特异性阻断PXR基因表达,可抑制结肠癌细胞增殖,提高结肠癌细胞化疗敏感性;5.核受体PXR可上调MRP3表达,参与PXR介导的结肠癌耐药。